流感病毒哺乳動(dòng)物細(xì)胞高產(chǎn)株的獲得及其反向遺傳技術(shù)平臺(tái)的建立.pdf

1、本研究的目的是：篩選高產(chǎn)的甲型流感病毒母株，獲得其全部8個(gè)基因片段的克隆，然后將高產(chǎn)毒株基因與流行毒株的HA和NA片段進(jìn)行重配，使疫苗株既保持高產(chǎn)的特性，又具有流行毒株抗原性的特點(diǎn)。這樣制備甲型流感疫苗，將是流感疫苗生產(chǎn)的重大變革。本研究的主要內(nèi)容包括： 1、篩選MDCK細(xì)胞高產(chǎn)的甲型流感病毒：通過(guò)大量篩選備選病毒(該系列毒株是細(xì)胞來(lái)源的)，以較低的MOI感染MDCK細(xì)胞，獲得哺乳動(dòng)物細(xì)胞高產(chǎn)病毒，并將其高產(chǎn)特性穩(wěn)定下來(lái)。

2、 2、細(xì)胞高產(chǎn)株全基因組克隆及序列測(cè)定：通過(guò)流感病毒通用引物反轉(zhuǎn)錄，特異引物PCR擴(kuò)增的方法，將該病毒8個(gè)基因節(jié)段全部擴(kuò)增出來(lái)，并克隆入中間載體。送測(cè)序，每節(jié)段至少3個(gè)克隆。獲得了全基因組cDNA序列，共計(jì)13588bp。 3、反向遺傳操作雙向雙表達(dá)載體的構(gòu)建：通過(guò)PCR反應(yīng)從質(zhì)粒PHH21上擴(kuò)增出一段含人源RNApolymeraseⅠ啟動(dòng)子和鼠源RNApolymeraseⅠ終止子的序列。將上述PCR產(chǎn)物的酶切片段連入真核細(xì)胞

3、表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，獲重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒特點(diǎn)是在RNApolymeraseⅡ啟動(dòng)子和終止序列之間嵌合了RNApolymeraseⅠ啟動(dòng)子和終止子元件。 4、細(xì)胞高產(chǎn)株反向遺傳操作8質(zhì)粒系統(tǒng)的構(gòu)建：通過(guò)酶切的方式將細(xì)胞高產(chǎn)株8個(gè)基因節(jié)段分別連入上述載體中，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染上清連續(xù)傳代，空斑純化獲重配病毒。 5、利用6+2重配系統(tǒng)獲得流行株的反向遺傳重配病毒株：將流行株的表面抗原HA，NA基因克隆入