單核細(xì)胞增生性李斯特菌srtA基因缺失株的構(gòu)建及其部分生物學(xué)特性研究.pdf

1、單核細(xì)胞增多性李斯特菌（listeria monocytogenes，LM）作為四大重要食源性病原菌之一，對(duì)人類及多種畜禽健康威脅極大，可以突破宿主的腸道屏障，血腦屏障和血胎屏障，臨床上引起腸胃炎、腦膜腦炎、敗血癥、流產(chǎn)等癥狀，尤其是對(duì)幼齡和妊娠母畜，發(fā)病急，死亡率高。LM細(xì)胞胞壁表面分布多種毒力蛋白，在感染機(jī)體過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中有一類至關(guān)重要的表面蛋白的前體蛋白 C端含有保守基序 LPXTG，SrtA是一種分選酶能夠識(shí)別表面蛋白

2、 C末端的保守基序 LPXTG，共價(jià)結(jié)合到肽聚糖上，呈現(xiàn)在細(xì)胞表面發(fā)揮毒力作用，是毒力蛋白可以錨定到細(xì)菌細(xì)胞壁過(guò)程中的關(guān)鍵。本研究以李斯特菌病綿羊腦組織臨床分離的單核細(xì)胞增多性李斯特菌（簡(jiǎn)稱 LM90SB2，4b血清型）為研究對(duì)象，首先對(duì) LM90SB2的 srtA基因進(jìn)行序列分析及原核表達(dá)；構(gòu)建 LM90SB2的 srtA基因缺失株（LM90SB2-△srtA），對(duì)比分析生化特性，生長(zhǎng)特性，對(duì)小鼠和不同種屬類型細(xì)胞的毒力等生物學(xué)功能，

3、為探究 LM的 SrtA分選的蛋白譜，尋找新的毒力蛋白研究奠定了重要基礎(chǔ)；在 LM致病機(jī)理研究中和藥物靶標(biāo)的篩選上同樣具有重要作用。
　　1. LM90SB2 srtA基因的序列分析與原核表達(dá)：為了探究 LM90SB2的 srtA基因的特異性及其在原核表達(dá)質(zhì)粒 pET32a中的表達(dá)。利用 PCR技術(shù)擴(kuò)增 LM90SB2的 srtA基因，測(cè)序后用 DANMAN軟件與已公布的標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行序列比對(duì)分析，將 srtA克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒 pE

4、T32a中構(gòu)成重組表達(dá)質(zhì)粒 pET32a-srtA。質(zhì)粒 pET32a-srtA轉(zhuǎn)化到蛋白表達(dá)菌株 E.coli BL21（DE3）中，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)使其表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)，同時(shí)采用 Western-blotting對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：LM90SB2與標(biāo)準(zhǔn)株 LMF2365(serovar4b，NC_002973) srtA基因的核苷酸同源性為100％；SrtA蛋白在 BL21（

5、DE3）中大量表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE電泳和 Western-blotting檢測(cè)分析其為一個(gè)分子量為47kD的融合蛋白與預(yù)期的大小相符合。
　　2. LM90SB2 srtA基因缺失株（LM90SB2-△srtA）的構(gòu)建與鑒定：基因缺失是研究基因功能常用的方法，本實(shí)驗(yàn)利用同源重組的方法構(gòu)建 LM90SB2 srtA基因缺失株（LM90SB2-△srtA），為研究 LM的 srtA基因的功能奠定基礎(chǔ)。用 Primer5.

6、0軟件設(shè)計(jì)融合引物，PCR擴(kuò)增 LM90SB2 srtA基因的上下游同源臂，運(yùn)用融合 PCR（SOE-PCR）的方法連接上下臂獲得缺失 srtA基因的同源片段（△srtA），連接到 pMD19-T構(gòu)成pMD19-T-△srtA，基因測(cè)序結(jié)果正確后將△srtA克隆到質(zhì)粒 pKSV7中構(gòu)成重組質(zhì)粒pKSV7-△srtA。將質(zhì)粒 pKSV7-△srtA電轉(zhuǎn)化入 LM90SB2中，篩選陽(yáng)性克隆，在高溫和10μg/ml氯霉素抗性條件下連續(xù)傳代，發(fā)

7、生同源重組，用兩對(duì)引物(srtAF1和 srtAR2，srtAF和 srtAR) PCR驗(yàn)證缺失片段。再置于無(wú)抗性的30℃條件下連續(xù)傳代獲得穩(wěn)定的srtA基因缺失株 LM90SB2-△srtA。在無(wú)氯霉素抗性的 BHI液體培養(yǎng)基中，37℃，180 rpm條件下連續(xù)傳代培養(yǎng)20代，PCR檢測(cè)無(wú)毒力返祖現(xiàn)象，表明該缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
　　3.對(duì)比分析 LM90SB2-△srtA部分生物學(xué)特性：對(duì)比分析缺失株 LM90SB2-

8、△srtA與野生株 LM90SB2的部分生物學(xué)特性的差異，來(lái)探究 srtA基因?qū)τ?LM90SB2毒力的影響。本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)比分析了細(xì)菌的生化特性、溶血效價(jià)、耐酸耐堿性、生物膜形成能力；對(duì)于 MBMEC，HBMEC，RAW264.7，SIEC的粘附，侵襲和胞內(nèi)增殖能力以及對(duì)BALB/c小鼠的致病能力影響。結(jié)果表明：srtA基因的缺失后，LM90SB2的生化特性、耐酸耐堿性無(wú)變化；溶血效價(jià)、生物膜形成能力稍有差異； LM90SB2對(duì)不同細(xì)胞

9、的粘附、侵襲和胞內(nèi)增殖能力不同，對(duì) RAW264.7的感染效率最高，對(duì)腦細(xì)胞的感染效率相對(duì)較低；srtA基因缺失后顯著降低了 LM90SB2對(duì) HBMEC，RAW264.7，SIEC細(xì)胞的粘附率和對(duì) MBMEC，RAW264.7，SIEC細(xì)胞的侵襲率（P<0.05），對(duì) LM90SB2在MBMEC，HBMEC，RAW264.7，SIEC中的增殖趨勢(shì)未有明顯影響，但細(xì)菌含量有所降低；srtA基因缺失后 LM90SB2對(duì) BALB/c雌性小