HPV18型E7抗原B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)與鑒定.pdf

1、目的：人乳頭瘤病毒（HPV）是一類感染表皮和粘膜鱗狀上皮的DNA病毒，其中，高危型HPV18與尖銳濕疣、宮頸上皮內(nèi)瘤以及其他上皮性腫瘤的發(fā)生相關(guān)。HPV18早期蛋白E7是特異性的腫瘤抗原，作為一種理想的靶抗原在免疫治療研究中倍受重視。本研究中，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助算法來(lái)篩選HPV18E7抗原的B細(xì)胞表位，并通過(guò)對(duì)其進(jìn)行免疫學(xué)評(píng)價(jià)進(jìn)一步鑒定預(yù)測(cè)的B細(xì)胞表位能否誘導(dǎo)抗原肽特異性抗體產(chǎn)生。為制備針對(duì)HPV18感染的治療性疫苗提供候選表位。

2、方法：①計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)。采用親水性方案、柔韌性方案、抗原指數(shù)方案及表面可能性方案對(duì)HPV18型E7抗原B細(xì)胞表位進(jìn)行綜合評(píng)估，確定候選的B細(xì)胞表位。②預(yù)測(cè)肽合成、純化及質(zhì)譜鑒定。采用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc方案合成多肽，合成的多肽經(jīng)RP-HPLC純化及純度分析，并用質(zhì)譜進(jìn)行定性鑒定。③表位多肽的免疫效果評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)組分別以P1、P2、P3三條合成肽免疫Balb/c小鼠，陰性組以生理鹽水作為對(duì)照，與弗氏完全佐劑混合乳化后于0、2、4周在腋下、腹股溝及

3、腹腔多點(diǎn)注射，于初次免疫后的1、3、5周，分別采集并制備各實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組小鼠血清。④收集人乳頭瘤病毒18型。收集新鮮宮頸癌標(biāo)本1例（PCR法檢測(cè)HPV18陽(yáng)性），將標(biāo)本碾碎、超聲破膜，離心收集HPV病毒。⑤間接ELISA法進(jìn)行鑒定。分別以合成肽段和宮頸癌組織上清液包被酶聯(lián)板，與采集的各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清結(jié)合，以陰性組小鼠血清作為對(duì)照。酶標(biāo)二抗為羊抗小鼠IgG，底物為TMB[四甲基聯(lián)苯胺]。用酶標(biāo)儀于492nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A值。

4、 結(jié)果：①綜合各方案分析考慮：人乳頭瘤病毒18E7蛋白的第15-22位，29-44位，51-59位，即E715-22（LEPQNEIP），E729-44（EQLSDSEEENDEIDGV），E751-59（ARRAEPQRH）可能是B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位。分別命名為P1、P2和P3。②多肽經(jīng)RP-HPLC純化及純度分析，合成肽的純度大于90%，經(jīng)質(zhì)譜分析合成肽的分子量測(cè)定值與理論值相符。⑨以三條多肽鏈包被酶聯(lián)板，與免疫后小鼠血清抗體結(jié)合反應(yīng)。

5、初次免疫后第1周，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清抗體滴度均呈陰性；第3周，表位多肽P2、P3組均出現(xiàn)陽(yáng)性，與陰性對(duì)照組具有顯著性差異，P1組為陰性；第5周，P1、P2、P3組均出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，與陰性對(duì)照組均有顯著性差異。④以宮頸癌組織上清液包被酶聯(lián)板，只有P2、P3組產(chǎn)生的小鼠血清抗體與其結(jié)合反應(yīng)呈陽(yáng)性，表位肽P1產(chǎn)生的抗體不呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。 結(jié)論：①多種預(yù)測(cè)方案聯(lián)合應(yīng)用可提高預(yù)測(cè)效率，避免了在研究人乳頭瘤病毒18E7抗原表位時(shí)盲目合成多肽。②人乳