HPV16-18 E7雙特異親和體分子對宮頸癌細胞的靶向結(jié)合研究.pdf

1、目的：①構(gòu)建pET21a(+)/ZHPV16E7384-ZHPV18E7228、pET21a(+)/ZHPV16E7384-2、pET21a(+)/ZHPV18E7228-2三個雙特異重組質(zhì)粒并鑒定，通過原核表達系統(tǒng)進行表達純化ZHPV16E7384-ZHPV18E7228 affibody（Z384-Z228）、ZHPV16E7384-2 affibody（Z384-2）、ZHPV18E7228-2affibody（Z228-2)重組

2、蛋白并進行驗證。②Z384-Z228、Z384-2、Z228-2分子進行體外親和力及特異結(jié)合力的檢測；③Z384-Z228、Z384-2、Z228-2分子在裸鼠荷瘤模型中的體內(nèi)靶向結(jié)合作用檢測。
　　方法：⑴本實驗室前期驗證的ZHPV16E7384affibody（Z384）和ZHPV18 E7228affibody（Z228）經(jīng)密碼子優(yōu)化后的核苷酸序列，以柔性肽G4S3連接，委托生物公司全基因合成并測序驗證；⑵將全基因合成成功并

3、測序正確的Z384-Z228、Z384-2、Z228-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達載體-大腸桿菌BL21（DE3）中，并通過IPTG（異丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)表達出Z384-Z228、Z384-2、Z228-2重組蛋白，隨后進行Ni-NTA樹脂親和層析的方法純化三個重組蛋白，同時誘導(dǎo)表達出相應(yīng)的affibody單體蛋白(Z384, Z228)及對照野生型Zwt蛋白，最后經(jīng)過SDS-PAGE電泳、DOT BLOT(斑點試驗)及W

4、esternBlotting分析鑒定。⑶與靶蛋白結(jié)合親和力分析：應(yīng)用SPR(表面等離子共振技術(shù))，分別檢測Z384-Z228、Z384-2、Z228-2與對應(yīng)靶蛋白HPV16E7和HPV18E7結(jié)合的親和力，并以Zwt作為對照蛋白。⑷與細胞表達靶蛋白結(jié)合特異性分析：選擇宮頸癌Siha細胞株（HPV16E7表達陽性）、宮頸癌HeLa229細胞株（HPV18E7陽性）及人黑色素瘤A375細胞株（HPV陰性）為研究對象。用間接免疫熒光的方法檢

5、測上述三個雙特異性重組蛋白分子與Siha細胞表達的HPV16E7蛋白、HeLa229細胞表達的HPV18E7蛋白的特異性結(jié)合能力，并以相應(yīng)的單體及Zwt作為對照蛋白。⑸對細胞半數(shù)有效抑制率的檢測：將Siha，Hela229細胞株分別孵育Z384-Z228、Z384-2、Z228-2重組蛋白，采用CCK8試劑盒檢測其對相應(yīng)細胞生長的抑制作用，并計算其相應(yīng)的半數(shù)有效抑制率IC50值。⑹對細胞生長抑制的作用的檢測：將Siha，Hela229，

6、細胞株分別孵育Z384-Z228、Z384-2、Z228-2重組蛋白和對照蛋白Zwt,采用CCK8試劑盒檢測其對相應(yīng)細胞生長的抑制作用。⑺體外靶向免疫組化水平驗證：將Siha，Hela229，A375細胞荷瘤裸鼠組中的腫瘤進行石蠟包埋病理切片，分別采用Z384-Z228、Z384-2、Z228-2三種重組蛋白及HIS抗體作為一抗檢測；同時將Zwt重組蛋白和PBS血清抗體分別作為對照，以檢測三個重組蛋白分別與相應(yīng)腫瘤組織所表達的靶抗原HP

7、V16E7、HPV18E7的特異性結(jié)合與識別能力。⑻建立宮頸癌荷瘤裸鼠模型：選擇3-4周齡BALB/c雌性裸鼠將其飼養(yǎng)在SPF級實驗環(huán)境中，觀察飼養(yǎng)一周后，將培養(yǎng)狀態(tài)良好的Siha,HeLa229細胞株懸液經(jīng)皮下接種在裸鼠腋窩靠近背部的左右兩側(cè)肩胛位置，左側(cè)接種Siha細胞，右側(cè)接種Hela229細胞，同時建立A375細胞荷瘤裸鼠模型組用以對照比較。待裸鼠成瘤后分別取瘤體提取組織DNA進行PCR鑒定和病理切片觀察。⑼HPV16/18 E

8、7雙特異affibody重組蛋白的近紅外熒光染料標記：調(diào)整affibody重組蛋白濃度至一致，避光條件下，按1:20的比例加入Dylight755熒光染料，用移液槍混勻插于冰盒中，放于4℃冰箱偶聯(lián)過夜，經(jīng)15％的SDS-PAGE電泳鑒定，放于小動物活體成像儀中拍片。⑽HPV16/18 E7雙特異affibody重組蛋白靶向腫瘤的近紅外成像定位分析：待宮頸癌細胞和A375黑色素瘤細胞（作為腫瘤對照組）荷瘤裸鼠腫瘤長至500mm3左右，將D

9、ylight755標記成功的Z384-Z228、Z384-2、Z228-2各200ul通過尾靜脈分別注射至小鼠體內(nèi)，并通過小動物活體近紅外成像系統(tǒng)分別采集0min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h及96h的圖像，分析不同時間點熒光的分布及代謝情況。同時以Zwt作為對照蛋白。
　　結(jié)果：①HPV16/18 E7雙特異affibody重組質(zhì)粒的構(gòu)建、原核表達及純化：經(jīng)全基因合成的Z384-Z22

10、8、Z384-2、Z228-2三個重組質(zhì)粒通過測序證實構(gòu)建成功；隨后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌原核表達系統(tǒng)進行誘導(dǎo)表達，采用Ni-柱樹脂親和層析的方法純化獲得了Z384-Z228、Z384-2、Z228-2三個重組蛋白，并經(jīng)SDS-PAGE鑒定在分子量約15kDa左右的位置處出現(xiàn)了單一條帶，與理論大小相符；進一步經(jīng)Dot blot Western Blot分析驗證正確。②SPR(表面等離子共振技術(shù))檢測結(jié)果顯示Z384-Z228雙特異與靶蛋白HPV

11、16、18E7均具有高親和力，Z384-2和Z228-2雙特異分別與相應(yīng)的靶蛋白HPV16E7和HPV18E7具有高親和力，對照蛋白Zwt則對HPV16、18E7蛋白幾乎沒有親和力。③細胞間接免疫熒光結(jié)果顯示，在孵育了相應(yīng)蛋白的細胞的細胞核及核周胞漿均出現(xiàn)了紫色點狀或團塊狀的熒光，證實了Z384-Z228能同時與宮頸癌細胞表達的HPV16E7、HPV18E7蛋白具有特異性結(jié)合力，而Z384-2僅與宮頸癌細胞表達的HPV16E7蛋白， Z

12、228-2僅與宮頸癌細胞表達的HPV18E7蛋白有特異性結(jié)合力。④細胞增值實驗結(jié)果驗證了Z384-Z228對Siha和HeLa229細胞均具有生長抑制作用，Z384-2和Z228-2對相應(yīng)的Siha和HeLa229細胞具有生長抑制作用。其對靶細胞的半數(shù)有效抑制率用IC50表示，Z384-Z228對Siha和HeLa229的IC50分別是1.618umol和3.127umol，Z384-2和Z228-2雙特異對Siha和HeLa229的I

13、C50分別是2.431umol和10.38umol。⑤運用免疫組織化學技術(shù)驗證了三個重組蛋白affibody分子與相應(yīng)腫瘤細胞所表達的HPV蛋白的特異性靶向結(jié)合力和識別力。在分別孵育了Z384-Z228的宮頸癌組織切片Siha、HeLa229細胞組的細胞核及細胞漿出現(xiàn)了與孵育陽性對照16E7兔多克隆血清抗體(Siha)、18E7兔多克隆血清抗體(HeLa229)一樣的深棕色沉淀，孵育了Z384-2的宮頸癌組織切片Siha細胞的細胞核及細

14、胞漿出現(xiàn)了深棕色沉淀，而對照細胞HeLa229、A375細胞組均未見；同樣在孵育了Z228-2的Hela229細胞組，也出現(xiàn)了類似的棕色沉淀，而Siha、A375細胞組均未見。⑥成功建立了荷瘤裸鼠腫瘤模型，并分別采用HPV16/18E7特異性引物，通過PCR技術(shù)對三組荷瘤裸鼠腫瘤中的HPV16/18E7基因進行檢測，結(jié)果顯示，Siha細胞腫瘤組織中HPV16 E7DNA為陽性，HPV18E7 DNA為陰性；HeLa229細胞腫瘤組織HP

15、V18E7DNA為陽性，HPV16 E7DNA為陰性；而A375細胞腫瘤組織HPV16和18 E7DNA均為陰性。⑦DYlight755標記結(jié)果：經(jīng)SDS-PAGE電泳避光鑒定，置凝膠于小動物近紅外成像儀檢測，通過小動物近紅外成像儀觀察，出現(xiàn)和相應(yīng)考染蛋白條帶大小一致的紅色熒光條帶，證實標記成功⑧將標記成功的affibody重組蛋白，通過尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)，經(jīng)活體小動物成像儀觀察不同時間點熒光分布及代謝情況，可知，在正常裸鼠體內(nèi)近紅外

16、標記的蛋白均出現(xiàn)5min呈全身性分布，隨著時間的延長，逐漸向腎臟聚集，8小時左右腎臟熒光信號表現(xiàn)為最強，最后逐漸消退，證實熒光標記的蛋白主要通過腎臟代謝。⑨DYlight755標記的雙特異affibody在荷瘤裸鼠體內(nèi)靶向腫瘤成像的檢測：Siha和HeLa229細胞移植瘤模型中，尾靜脈注射的DY755-Z384-Z228熒光蛋白呈現(xiàn)出5min全身分布，隨后逐漸向左右腫瘤部位聚集，4小時達到最高峰，隨后慢慢消退，持續(xù)至48小時，與僅對16

17、E7特異性識別的DY755-Z384-2，18E7特異性識別的DY755-Z228-2相比較而言，DY755-Z384-Z228體現(xiàn)了雙重識別能力，而在尾靜脈注射所有近紅外熒光標記重組蛋白的對照A375荷瘤裸鼠組中均沒有出現(xiàn)一個特異性的腫瘤部位的熒光聚集。
　　結(jié)論：⑴成功表達了對HPV16E7和HPV18E7具有雙特異性結(jié)合的affibody分子重組蛋白；⑵通過表面等離子體共振（SPR）技術(shù)及間接細胞免疫熒光、免疫組織化學術(shù)分別