非小細(xì)胞肺癌中TGFβRI基因異常表達(dá)的microRNA調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的:本研究旨在探討NSCLC中TGFβRI異常表達(dá)的microRNA調(diào)控機(jī)制,為NSCLC的早期診斷和治療提供確鑿的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:(1)Real-Time PCR和Western Blot方法分別檢測(cè)在人正常支氣管細(xì)胞HBE和5株NSCLC細(xì)胞以及49對(duì)NSCLC組織樣本中TGFβRI基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平。(2)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)分析能夠靶向TGFβRI3’UTR區(qū)域的microRNAs,即microRNAs的初

2、步篩選。然后合成microRNAs的模擬體mimics和microRNAs inhibitor mimics,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后TGFβRI mRNA和蛋白表達(dá)變化,篩選出可以改變TGFβRI基因表達(dá)的microRNAs。并且運(yùn)用雙熒光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相關(guān)microRNAs是否與TGFβRI3’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合,對(duì)初步篩選出的microRNAs進(jìn)一步篩選。(3)qRT-PCR方法檢測(cè)在人正常支氣管細(xì)胞HB

3、E、5株NSCLC細(xì)胞和49對(duì)NSCLC組織樣本中最后篩選出的相關(guān)microRNAs的表達(dá)情況,并將其和TGFβRI的表達(dá)作回歸分析,統(tǒng)計(jì)出NSCLC中TGFβRI和相關(guān)microRNAs表達(dá)的相關(guān)性。(4)構(gòu)建最后篩選出的microRNAs的過表達(dá)載體和抑制載體,通過慢病毒Lenti-X表達(dá)系統(tǒng)篩選獲得可以穩(wěn)定高表達(dá)相關(guān)microRNA的A549細(xì)胞以及能持續(xù)低表達(dá)相關(guān)microRNA的單克隆A549細(xì)胞。并且運(yùn)用Real-Time

4、PCR和Western Blot技術(shù)對(duì)篩選出的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株進(jìn)行鑒定,最后獲得轉(zhuǎn)染效率最佳的A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,用無血清清的RPMI1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)過夜,然后用TGF-β1刺激A549細(xì)胞6 h,最后檢測(cè)TGF-β通路主要效應(yīng)分子pSMAD3的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)a、與HBE相比,TGFβR1 mRNA和蛋白在NSCLC細(xì)胞株A549、LTEP-a-2、H1299和95C中的表達(dá)均是下降的。b、在49例NSCLC組織樣本中T

5、GFβR1 mRNA表達(dá)下調(diào)(p<0.05)。c、在24例NSCLC組織中,TGFβR1蛋白表達(dá)水平較癌旁組織是下降的(p<0.05)。綜上所述,TGFβR1基因在NSCLC中的表達(dá)是下降的。(2)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)分析多個(gè)microRNAs可以與TGFβR1基因的3’UTR區(qū)域結(jié)合,通過microRNAs模擬體mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染以及Dual Luciferase Reporter Assay實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,最后篩選出只有miR-142-3

6、p可以影響TGFβR1基因的mRNA和蛋白表達(dá)并且這種作用是通過miR-142-3p與TGFβR1基因的3’UTR種子序列直接結(jié)合引起的。(3)與HBE相比,在NSCLC細(xì)胞株 A549、LTEP-a-2、H1299和95C中miR-142-3p的表達(dá)是上升的。在49例 NSCLC組織樣本中miR-142-3p的表達(dá)也是上升的。也就是說,在NSCLC中miR-142-3p是高表達(dá)的。將其和TGFβRI的表達(dá)作回歸分析發(fā)現(xiàn)NSCLC中兩者

7、的表達(dá)之間是負(fù)相關(guān)的。(4)成功構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)miR-142-3p的A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和持續(xù)低表達(dá)miR-142-3p的單克隆A549細(xì)胞株,饑餓培養(yǎng)過夜后用TGF-β1刺激6 h,Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示在TGF-β通路里miR-142-3p可以降低pSMAD3的表達(dá)。
　　結(jié)論:NSCLC中miR-142-3p能夠直接靶向TGFβR1的3’UTR種子序列。miR-142-3p高表達(dá)而TGFβR1基因低表達(dá)并且兩者之