“全生物化”組織工程血管構(gòu)建的實驗研究.pdf

1、目的:建立分離骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法。探討應(yīng)用骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞作種子細(xì)胞、以血管脫細(xì)胞基質(zhì)為支架構(gòu)建“全生物化”組織工程血管的可能性。
　　 方法:梯度密度離心法分離人和豬骨髓單核細(xì)胞,應(yīng)用內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液EGG-2體外培養(yǎng)。應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)鑒定內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志:CD34、CD31、FLK-1、ve-Cadherin、vWF及前體細(xì)胞標(biāo)志CD133。然后應(yīng)用含20no/ml血小板衍生生長因子BB的EGG一2培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4天、10天后鑒

2、定a-SMA和Calponin。同期應(yīng)用胰酶、SDS處理和反復(fù)凍融的多步驟法制備犬動脈脫細(xì)胞基質(zhì)。電鏡、病理及力學(xué)檢測脫細(xì)胞效果,檢測基質(zhì)力學(xué)特性。最后以培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞作種子細(xì)胞靜態(tài)種植于脫細(xì)胞基質(zhì),構(gòu)建組織工程血管并移植到骨髓供體豬頸動脈或左肺動脈。術(shù)后行導(dǎo)管檢查,觀測管道通暢情況。3個半月后處死動物,觀測組織工程血管形態(tài)、病理、力學(xué)特性。
　　 結(jié)果:1、應(yīng)用內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液培養(yǎng)梯度密度離心分離的骨髓單核細(xì)胞,最終分離出

3、骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞,表達(dá)祖細(xì)胞標(biāo)志CD133和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31、VE-Cadherin、vWF。培養(yǎng)至第4周,細(xì)胞總數(shù)達(dá)到108,可以滿足血管組織工程對種子細(xì)胞的數(shù)量要求。2、內(nèi)皮祖細(xì)胞經(jīng)過PDGF-BB的誘導(dǎo)可以分化出平滑肌細(xì)胞。誘導(dǎo)第十天a-SMA陽性細(xì)胞達(dá)到64％。未經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞最終分化成內(nèi)皮細(xì)胞。3、應(yīng)用胰酶消化和SDS漂洗及反復(fù)凍融處理,犬動脈僅留下比較完整的管形支架,所有細(xì)胞成分被完全清除。其抗撕斷能力、拉伸特性保持良好。4、

4、種植內(nèi)皮祖細(xì)胞于基質(zhì)后在其表面形成一層完整的內(nèi)皮細(xì)胞層,與正常血管近似。移植到頸動脈的血管20天后明顯狹窄。移植到肺動脈的血管保持通暢,3個半月后管道與正常血管相比最大負(fù)載相似,但彈性弱于正常血管。血管內(nèi)表面形成一層連續(xù)完整的內(nèi)皮細(xì)胞,中層有平滑肌細(xì)胞,細(xì)胞排列近似正常血管。
　　 結(jié)論:1、人和豬骨髓中均存在內(nèi)皮祖細(xì)胞,應(yīng)用密度梯度離心法結(jié)合EGM-2培養(yǎng)液的選擇可以分離出骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞。2、PDGF-BB可以誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞定