草魚基因組文庫構(gòu)建篩選及兩個(gè)核心MHCⅠ基因座序列圖譜研究.pdf

1、為研究草魚抗病基因的基因組結(jié)構(gòu)，發(fā)掘草魚自身抗病基因和免疫相關(guān)基因，同時(shí)為了推進(jìn)比較基因組的研究。在本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)報(bào)道了26條草魚MHC Ⅰ(Ctid-MHC Ⅰ)cDNA序列，分析了多態(tài)性，并對Ctid-MHC Ⅰ基因組進(jìn)行了初步分析的工作基礎(chǔ)上，希望通過對Ctid-MHC Ⅰ基因組結(jié)構(gòu)的分析，闡明Ctid-MHC Ⅰ在基因組中的分布、數(shù)目及相互的關(guān)系，從而可以為Ctid-MHC Ⅰ的功能研究提供依據(jù)。 首先用已知cDNA序列的

2、草魚(fish C)的MHC Ⅰ的α3區(qū)做探針，對EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ，HindⅢ，三種酶切的基因組進(jìn)行了Southern雜交。在獲得草魚MHC Ⅰ基因組信息的基礎(chǔ)上，借助fosmid文庫研究功能基因的獨(dú)特優(yōu)勢，我們將草魚(fish C)DNA，機(jī)械裂解后，經(jīng)末端補(bǔ)平，瓊脂糖凝膠電泳回收25-45kb的DNA片段，與同樣平末端的PcclFOS載體連接，經(jīng)λ噬菌體包裝轉(zhuǎn)染EP1300大腸桿菌后，鋪板，挑單菌落保存于96孔板，最終構(gòu)建

3、了草魚fosmid文庫，命名為GCFL。為驗(yàn)證GCFL的庫容與質(zhì)量，用脈沖場電泳分析了50個(gè)經(jīng)Not Ⅰ酶切隨機(jī)挑選的克隆，并用3D-PCR技術(shù)對GCFL進(jìn)行了11個(gè)功能基因(MHC Ⅰ，MHC Ⅱα，MHC Ⅱβ，IFN-α，Mx，CD8α，IgMCH4，β2m，C3b，GH，β肌動蛋白)的篩選。 然后挑選兩個(gè)含MHC Ⅰ的fosmid克隆命名為GCFL-0405E6、GCFL-07311G8，分別搖菌提取質(zhì)粒DNA后，超聲波

4、裂解，經(jīng)末端補(bǔ)平，瓊脂糖凝膠電泳回收2．3kb的DNA片段，與同樣平末端的pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)入JM109大腸桿菌中，然后鋪板，建立亞克隆庫。隨機(jī)挑菌經(jīng)鑒定后測序。進(jìn)行序列拼接，最后獲得了兩個(gè)長度分別為33kb和36.3kb的草魚基因組序列，并對其進(jìn)行了基因預(yù)測、啟動子分析和同源性比較等一系列研究。 結(jié)果顯示：通過Southern雜交，MHC Ⅰα3區(qū)與三種酶切的基因組有4條帶，推斷草魚的2倍體基因組可能有2個(gè)基因座，4個(gè)等

5、位基因；同時(shí)我們成功構(gòu)建了草魚fosmid基因組文庫，構(gòu)建的GCFL包含129,014克隆，單克隆保存于96孔板中，文庫含有1344塊96孔儲菌板，每12塊96孔板組成一個(gè)超級池，文庫一共由112個(gè)超級池構(gòu)成。通過脈沖場電泳分析經(jīng)Not Ⅰ酶切的fosmid克隆，顯示平均插入片段為35kb，通過計(jì)算GCFL覆蓋了4.1倍草魚基因組。用3D-PCR法篩選的11個(gè)功能基因，陽性克隆個(gè)數(shù)為1-6，通過在斑馬魚的染色體定位顯示這些基因可能遍布于

6、草魚不同染色體上，證明從GCFL中可以篩到任何有用的功能基因。 在克隆GCFL-07311G8和GCFL-0405E6中，包含的完整的MHC Ⅰ基因，分別命名為：Citd-UAA和Citd-UBA。通過基因預(yù)測、啟動子分析和同源性比較等分析認(rèn)為：Citd-UAA和Citd-UBA是經(jīng)典的MHC Ⅰ基因，都具有表達(dá)功能，兩者屬于草魚MHC Ⅰ基因的不同等位基因座，與Southern雜交結(jié)果，草魚可能有2個(gè)MHC Ⅰ等位基因座相符。