蟲(chóng)草核苷類(lèi)成分檢測(cè)方法的建立與蟲(chóng)草多糖組成分析.pdf

1、蟲(chóng)草是一種重要的藥用資源，但對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻，產(chǎn)量相對(duì)較低，因此價(jià)格昂貴。近年來(lái)，諸多學(xué)者嘗試人工培植蟲(chóng)草或發(fā)酵蟲(chóng)草菌以獲得相應(yīng)的蟲(chóng)草產(chǎn)品來(lái)緩解蟲(chóng)草資源供不應(yīng)求的局面。蟲(chóng)草及蟲(chóng)草產(chǎn)品種類(lèi)繁多，故其質(zhì)量的準(zhǔn)確評(píng)價(jià)及有效成分的含量測(cè)定成為關(guān)鍵。本研究通過(guò)高效液相色譜、紅外光譜等手段對(duì)蟲(chóng)草中核苷類(lèi)及多糖成分進(jìn)行分析，以期建立蟲(chóng)草有關(guān)成分的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方法;通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)蟲(chóng)草菌產(chǎn)多糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以提高蟲(chóng)草多糖的產(chǎn)量。因此，本研究旨在

2、對(duì)蟲(chóng)草資源的全面評(píng)價(jià)及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù)。本文主要研究結(jié)果如下:
　　1、通過(guò)提取方法的比較和正交試驗(yàn)確定了蟲(chóng)草核苷類(lèi)成分的最佳提取方法為超聲提取法，最佳提取工藝為:以超純水為提取溶劑，料液比為1∶50，常溫超聲提取30min。確定了蟲(chóng)草核苷類(lèi)成分的檢測(cè)方法，使用中科安泰C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，最佳色譜條件為:檢測(cè)波長(zhǎng):260nm;流動(dòng)相為A（甲醇）-B（水）二元梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?0～10mi

3、n，5％→10％A;10～20min，5％→20％A;20～35min，20％→10％A;35～40min，10％→5％A;流速:0.5mL/min;進(jìn)樣量:10μL;柱溫:25℃;檢測(cè)時(shí)間:40min;進(jìn)樣間隔:5min。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法線性關(guān)系良好、精密度高，適用性、重復(fù)性、加樣回收率均符合2015版藥典要求。
　　2、對(duì)蟲(chóng)草及發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉中核苷類(lèi)成分進(jìn)行測(cè)定與比較，結(jié)果顯示冬蟲(chóng)夏草蟲(chóng)體中所含的核苷類(lèi)成分種類(lèi)最多，但蟲(chóng)草素

4、未檢出;人工蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中腺苷、尿苷、胸苷含量相對(duì)較高，蟲(chóng)草素含量高達(dá)3265.88μg/g;冬蟲(chóng)夏草菌CC-9發(fā)酵菌絲體中檢出了5種核苷類(lèi)成分，其中尿嘧啶和胸苷含量相對(duì)較高;冬蟲(chóng)夏草菌CC-10發(fā)酵菌絲體中蟲(chóng)草素未檢出，但含有的核苷類(lèi)成分種類(lèi)較多且含量較高，檢出肌苷含量為158.24μg/g，而在其他菌絲體中未檢出;蛹蟲(chóng)草YC-1發(fā)酵菌絲體中蟲(chóng)草素含量為193.97μg/g，是本試驗(yàn)唯一檢出蟲(chóng)草素的菌株，尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷含量均較高;蛹

5、蟲(chóng)草YC-2發(fā)酵菌絲體中尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷含量最高，分別為4641.64μg/g、4214.05μg/g、2460.03μg/g，但蟲(chóng)草素未檢出。
　　3、采用響應(yīng)面法對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌CC-10和蛹蟲(chóng)草菌YC-1產(chǎn)多糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果CC-10菌株最佳培養(yǎng)基配方為:葡萄糖9.32g/L、麥芽糖18.79g/L、蛋白胨6.14g/L、豆餅粉4g/L、MgSO40.5g/L、KH2PO41g/L、VB20.5mg/L，此時(shí)胞內(nèi)多

6、糖含量為4.16％，是優(yōu)化前的2.06倍。YC-1菌株最佳培養(yǎng)基配方為:蔗糖20.75g/L、蛋白胨8.17g/L、酵母浸粉5g/L、KH2PO41g/L、MgSO41.20g/L、ZnSO40.5g/L、VB10.1g/L，多糖含量為6.77％，是優(yōu)化前的2.34倍。
　　4、采用乙醇分級(jí)沉淀法對(duì)YC-1菌株和CC-10菌株的胞內(nèi)及胞外多糖進(jìn)行提取，進(jìn)一步純化后采用紅外光譜法對(duì)各多糖組分進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示10種組分均具有多糖特征

7、吸收峰，其中YC-1菌株ESP1在819cm-1處和CC-10菌株ISP1在811cm-1處的吸收峰表征其含有甘露糖。CC-10菌株ISP2在835cm-1和889cm-1處的吸收峰表征其含有α和β糖苷鍵，ESP1在835cm-1處的吸收峰表征含有α-糖苷鍵。采用PMP柱前衍生高效液相色譜法對(duì)單糖組成進(jìn)行分析，結(jié)果為YC-1菌株和CC-10菌株的胞內(nèi)及胞外多糖主要含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸四種單糖，但每種多糖組分中單糖的種類(lèi)