一株抗黃萎病的番茄內(nèi)生放線菌的分離、篩選和鑒定.pdf

1、隨著番茄栽培面積不斷擴(kuò)大，越來越多不合理的栽培方式出現(xiàn)在生產(chǎn)實(shí)踐中，加上倒茬困難，連年種植，設(shè)施蔬菜常發(fā)生植株生育遲緩、生長勢下降、品質(zhì)變劣、土傳病原菌大量積累、真菌性病害大量發(fā)生等現(xiàn)象。黃萎病是設(shè)施番茄中最主要的病癥之一，已成為限制番茄生產(chǎn)和商品化的瓶頸問題。放線菌一類具有分枝的絲狀細(xì)胞和菌絲的一類細(xì)菌，廣泛存在于不同的自然生態(tài)環(huán)境中。其多樣性豐富，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)得到次級代謝產(chǎn)物具有諸多優(yōu)良功效。許多放線菌對植物真菌性病害都有高效防治作用

2、。同時，許多放線菌還表現(xiàn)出了一定的促生作用。作為目前相對較新的方向，植物內(nèi)生放線菌以其得天獨(dú)厚的天然優(yōu)勢，越來越受到生物防治及相關(guān)領(lǐng)域的關(guān)注，并且很多高效活性放線菌株已經(jīng)作為優(yōu)勢菌源進(jìn)行商品化加工成為生防菌劑和生物有機(jī)肥等。
　　為了發(fā)掘具有高效生防作用的植物內(nèi)生放線菌資源，本研究選用5種高效分離培養(yǎng)基分別對已充分研磨的健康和發(fā)病番茄植株的根內(nèi)和根際土壤中的放線菌分離和純化培養(yǎng)。將獲得的菌株通過培養(yǎng)特征和菌落形態(tài)學(xué)特征初步去除重復(fù)

3、，然后通過體外平板抑制試驗(yàn)分別對放線菌的孢子懸浮液和發(fā)酵液進(jìn)行抑制真菌活性篩選。配合田間進(jìn)行的番茄苗期試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證放線菌的抗病和促生作用，及其在根內(nèi)和根際的定殖能力。將篩選后得到的高效拮抗菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列擴(kuò)增并測序。結(jié)合形態(tài)培養(yǎng)學(xué)特征和生理生化特性研究，對活性菌株進(jìn)行多相分類鑒定，最終獲得并確定目的放線菌株。為今后開發(fā)和利用植物內(nèi)生放線菌資源的抗病性篩選提供數(shù)據(jù)支持和實(shí)踐基礎(chǔ)，為內(nèi)生放線菌分離源的針對性選擇提供參考依

4、據(jù)，同時對未來生產(chǎn)實(shí)踐中生防菌劑的制備和使用積累生防菌資源。
　　本研究主要結(jié)果如下:
　　(1)以發(fā)病番茄植株和緊鄰的健康作為分離源，共分離得到的86株不同放線菌。其中50株來自健康植株，36株來自發(fā)病植株。根內(nèi)共分離純化得到32株放線菌，根際土壤中得到54株。
　　(2)對分離純化出的86株植物內(nèi)生放線菌進(jìn)行體外抑菌活性檢測。其中8株對黃萎病菌表現(xiàn)出明顯抑制作用。在這8株拮抗菌中，3株來自健康植株(HHV1-5、H

5、GS2-9、HAAG3-8);5株來自發(fā)病植株(DDPA1-2、DHV3-2、DAAG1-10、DGS3-6、DGS2-8)。其中DHV3-2對番茄黃萎病菌表現(xiàn)出了最大抑制活性，抑制半徑顯示為18.2mm。其抑制活性顯著高于其他放線菌。此外，DHV3-2還對很多病原真菌都顯示出了抑制作用。
　　(3)對放線菌DHV3-2進(jìn)行了多相分類學(xué)鑒定。通過分子生物學(xué)鑒定、形態(tài)培養(yǎng)特征鑒定以及生理生化特性鑒定，最終確定該菌株屬于鏈霉菌屬。

6、r>　　(4)通過番茄苗期試驗(yàn)驗(yàn)證，接種高濃度內(nèi)生放線菌DHV3-2對番茄黃萎病具有明顯的抑制作用，發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著降低;且具有一定的促生長效果，接種放線菌可以顯著提高番茄幼苗的株高、地上部鮮質(zhì)量和全株鮮質(zhì)量;且在番茄幼苗的根組織和根際土壤中均有一定的定殖能力。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中，相較于根組織，在番茄根際土壤中可培養(yǎng)放線菌的種類更為豐富。相較于番茄健康株，在番茄發(fā)病株中發(fā)現(xiàn)了更多不同的活性放線菌。通過體外抑菌試驗(yàn)篩選出