BYZX體外吸收、代謝及藥物相互作用研究.pdf

1、阿爾茨海默癥(簡(jiǎn)稱AD)又稱老年癡呆癥，是一種不可逆的、漸進(jìn)性的腦功能障礙，臨床表現(xiàn)為記憶障礙，智力減退并伴有其他認(rèn)知功能損害。AD的病因以及藥物防治是一個(gè)非常復(fù)雜的疑難問題，目前使用的治療方法是用藥物干擾病情的進(jìn)展。迄今為止用于AD癥治療的藥物有很多，但都因副作用及毒性等原因不如人意。 BYZX為茚酮類化合物，它是在第二代AD治療藥物多奈哌齊的基礎(chǔ)上通過結(jié)構(gòu)修飾合成的新化合物，是用于治療阿爾茨海默病的膽堿酯酶(AchE)抑制劑

2、，能夠增加大腦乙酰膽堿含量，可有效的治療早、中期老年性癡呆。 在研究過程中，了解BYZX的體外吸收、代謝情況，預(yù)測(cè)其可能存在的藥物相互作用，對(duì)此化合物作為候選藥物的開發(fā)前景預(yù)測(cè)，及其臨床用藥安全性具有重要意義。本文通過對(duì)BYZX的體外吸收、代謝及其藥物相互作用研究，獲得BYZX與P-糖蛋白相互作用關(guān)系，體外代謝途徑和藥物相互作用信息，從而為探討其作為新藥的研發(fā)前景、與其他藥物合用時(shí)的安全性、合理性提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 1．BY

3、ZX與P-糖蛋白相互作用研究 目的：建立Beap37及Beap37/MDRl細(xì)胞內(nèi)測(cè)定BYZX的．RP-HPLC法，通過藥物在兩種細(xì)胞中的積聚試驗(yàn)，考察BYZX是否為P．糖蛋白的底物。另外以羅丹明123為底物，考察BYZX是否是P．糖蛋白的抑制劑。 方法：將生長(zhǎng)良好的Bcap37及Bcap37/MDRl細(xì)胞種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，棄去上清液，加入含BYZX的完全培養(yǎng)基，孵育一定時(shí)間后，棄去上清液，用冰冷的PBS液洗

4、去細(xì)胞外層藥物，破碎細(xì)胞后加入內(nèi)標(biāo)溶液，用二氯甲烷提取揮干，流動(dòng)相溶解后進(jìn)樣分析，用BCA蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)每孔總蛋白量。以每孔測(cè)得的BYZX量除以總蛋白量來表示其在細(xì)胞內(nèi)的積聚量，比較BYZX在Bcap37及Bcap37/MDRl細(xì)胞內(nèi)積聚的差異，從而確定BYZX是否是P-糖蛋白的底物。采用的色譜條件為Diamonsil Cl8(迪馬公司)(250mm×4.6mmi.d，5μm)色譜柱，乙腈-10mmol.L-1KH2PO4(含TEA

5、 0.8％，用磷酸調(diào)pH=4.0)(25：75，v/v)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為325nm，流速為1.0mL.min-1，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為20UL。在判斷BYZX是否為P-糖蛋白抑制劑的實(shí)驗(yàn)中，加入含羅丹明123培養(yǎng)基后，繼續(xù)加入不同濃度的BYZX，孵育一定時(shí)間后，棄去上清液，用冰冷的PBS液清洗后，破碎細(xì)胞，測(cè)定熒光強(qiáng)度。 結(jié)果：BYZX在.0.1μml.L-1～20μmol.L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，在高、中、低不同濃

6、度下測(cè)得BYZX平均絕對(duì)回收率為86.07％~90.49％(n=5)，平均相對(duì)回收率為91.83％～98.51％(n=5)，平均方法回收率為97.10％～117.10％(n=5)，日內(nèi)精密度為1.16％～5.09％，日間精密度為2.38％～6.81％，定量限為0.1μml.L-1(RSD<5％，n=5)，檢測(cè)限為0.026μmol.L-1(S/N=3)。比較了BYZX在Bcap37及Bcap37/MDRl細(xì)胞內(nèi)不同時(shí)間下的積聚量，結(jié)果無

7、明顯差異(P>0.05)。羅丹明123在0.01～0.4μmol.-1L范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系，在高、中、低不同濃度下測(cè)得的羅丹明123的平均絕對(duì)回收率為98.60％，平均方法回收率為103.40％，日內(nèi)精密度為2.47％～5.27％，日問精密度為5.63％～6.92％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度的BYZX對(duì)羅丹明123的外排沒有明顯的抑制作用(P>0.05)。 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BYZX與P-糖蛋白沒有明顯的相互作用，不會(huì)被P一糖蛋

8、白外排到細(xì)胞外而影響其吸收。 2．BYZX在人體肝微粒體中的代謝研究 目的：研究用于治療阿爾茨海默病新化合物BYZX的體外代謝，并對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定代謝途徑。 方法：將BYZX與人肝微粒體進(jìn)行體外共孵育，孵育一定時(shí)間后用冰冷的含內(nèi)標(biāo)的乙腈終止反應(yīng)，沉淀蛋白后取上清液進(jìn)樣分析，測(cè)定孵育液中BYZX的剩余量及其代謝產(chǎn)物的量，并采用Finnigan LcQ DecaXpply離子阱質(zhì)譜進(jìn)行代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)確定。H

9、PLC的色譜條件為：以Diamonsil C18為色譜柱(迪馬公司)(25mm×4.6mm i.d，5μm)，乙腈-10mmol.L-1KH2PO4(含TEA0.8％，用磷酸調(diào)pH=4.0(28：72，v/v)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為325nm，流速為0.8mL.min-1，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為 20μL。 結(jié)果：BYZX在5.07μmol.L-1～101.37μmol.L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，日間及日內(nèi)精密度均小于5％(n=

10、5)，檢測(cè)限為0.73μmol.L-1(S/N=3)，定量限為2.49μmol.L-1(RSD<7％，n=5)，在高、中、低不同濃度下測(cè)得BYZX平均絕對(duì)回收率為106．2％1 116.4％(n=5)，平均相對(duì)回收率為102.2％~103.9％(n=5)，平均方法回收率為994％～102.1％(n=5)，BYZX在人肝微粒體中代謝的Km為53.25±17.2μmol.L-1，Vmax0.94±0.77μmol.L-1.min-1.mg-

11、1蛋白，Clint為0.018±0.02ml-1.min-1.mg-1蛋白。經(jīng)HPLC-MS-MS鑒定，N-去乙基BYZX是BYZX的主要代謝產(chǎn)物，通過酶抑制實(shí)驗(yàn)確定，BYZX主要由CYP3A4酶代謝。 結(jié)論：BYZX在人肝微粒體中主要由CYP3A4酶介導(dǎo)發(fā)生一相代謝反應(yīng)，主要代謝產(chǎn)物為N-去乙基BYZX。 3．BYZX與一些藥物的相互作用研究 目的：研究BYZX與一些藥物的代謝性相互作用，及其對(duì)CYP酶的抑制作

12、用，為此候選化合物的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：將一些藥物與BYZX在人肝微粒體中共孵育。這些藥物包括：酒石酸托特羅定等4種泌尿系統(tǒng)藥，布洛芬等5種解熱鎮(zhèn)痛藥，鹽酸多巴酚丁胺等12種心血管類藥，阿洛西林鈉等4種抗菌藥，氯丙嗪等4種抗抑郁藥，撲爾敏等5種抗過敏藥，非洛地平等7種地平類藥物。觀察這些藥物與BYZX在人肝微粒體中共孵育后對(duì)BYZX代謝的影響。測(cè)定IC50或Kj值。另選擇CYP3A4、CYP1A2、CYP2C9、CY

13、P2D6、CYP2C19、CYP2E1的專屬底物與BYZX共孵育，觀察BYZX對(duì)這些底物代謝的影響。 結(jié)果：地平類藥物對(duì)BYZX代謝有較強(qiáng)的抑制作用，ki值為11.44～33.25μmol.L-1。其中，西尼地平抑制作用最強(qiáng)，kj值為11.44±0.61μmol.L-1，而非洛地平相對(duì)其他地平類藥物來說抑制作用最弱，Kj值為33.25±0.05μmol.L-1?？挂钟羲幏趁?、氯丙嗪、鹽酸舍曲林、鹽酸氟西汀對(duì)BYZX代謝有一定

14、的抑制作用，其：IC50值分別為55.55μmol.L-1，74.81μmol.L-1，75.12μmol.L-1和77.03μmol.L-1。心血類藥物中只有硫酸奎尼丁對(duì)BYZX代謝有弱的抑制作用，其IC50為80.4μmol.L-1。泌尿系統(tǒng)藥、解熱鎮(zhèn)痛藥、抗過敏藥、抗菌藥對(duì)BYZX代謝均無明顯的影響。BYZX對(duì)CYP3A4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2C19、CYP2E1的專屬底物睪酮和硝苯地平，咖啡因和非那