中華眼鏡蛇α-神經(jīng)毒的純化及其在nAChR純化上的應(yīng)用.pdf

1、【背景】蛇毒，是由蛇的毒腺分泌，含有多種天然的多肽組分，包括心臟毒素，神經(jīng)毒素（neurotoxins，NTs），磷脂酶A2，蛇毒因子等。根據(jù)淀粉凝膠電泳可將銀環(huán)蛇神經(jīng)毒素分成α，β兩類(lèi)，其中α-神經(jīng)毒素作用于突觸后膜，β-神經(jīng)毒素作用于突觸前膜。根據(jù)氨基酸組成的不同，又可將α-神經(jīng)毒素分為兩類(lèi)，Ⅰ類(lèi)神經(jīng)毒素由70-74個(gè)氨基酸組成，含5對(duì)二硫鍵，被稱(chēng)為長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素，與骨骼肌中的煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcho

2、line receptor，nAChR）親和力非常高；Ⅱ類(lèi)神經(jīng)毒素中含有60-62個(gè)氨基酸，4對(duì)二硫鍵，被稱(chēng)為短鏈神經(jīng)毒素，與nAChR的親和力較Ⅰ類(lèi)低。國(guó)際上通常從印度眼鏡蛇（Naja naja naja）、泰國(guó)眼鏡蛇（Naja naja Siamensis）或孟加拉眼鏡蛇（Naja naja Kaouthia）的毒液中純化α-神經(jīng)毒素，后者通常被稱(chēng)為眼鏡蛇毒素（cobra toxin）。由于眼鏡蛇毒素與nAChR的親和力適中，所以也

3、通常用于nAChR的純化。中華眼鏡蛇（Naja naja atra）在我國(guó)南方廣泛分布，在蛇園中也有大規(guī)模的飼養(yǎng)，其毒液價(jià)格便宜，但沒(méi)有相關(guān)報(bào)道是否能以其毒液中的α-神經(jīng)毒素作為親和配體純化nAChR。所以，我們嘗試從中華眼鏡蛇的蛇毒中分離純化α-神經(jīng)毒素，以期獲得足夠量的毒素，用于nAChR的純化，進(jìn)而建立重癥肌無(wú)力主動(dòng)免疫動(dòng)物模型。
　　【目的】從中華眼鏡蛇粗毒中分離其α-神經(jīng)毒素組分，利用純化的α-神經(jīng)毒素作為親和層析的配基

4、耦聯(lián)至瓊脂糖凝膠上，制備成α-神經(jīng)毒-瓊脂糖凝膠作為介質(zhì)，從大鼠骨骼肌中純化nAChR。
　　【方法】采用凝膠過(guò)濾層析分離出蛇毒中的低分子量蛋白，并通過(guò)125I-α-銀環(huán)蛇毒素（αBtx）-nAChR結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白活性，選擇活性高的蛋白進(jìn)一步用陽(yáng)離子交換層析純化，逐步分離出眼鏡蛇α-神經(jīng)毒，SDS-PAGE分析蛋白分子量大小和純度；將純化的α-神經(jīng)毒耦聯(lián)至NHS-活化的瓊脂糖凝膠上，作為介質(zhì)結(jié)合大鼠骨骼肌肌膜提取物中nACh

5、R，0.2 mol/L卡巴膽堿將受體洗脫至羥基磷灰石層析柱上，并以250 mmol/L磷酸緩沖液洗脫收集，以放射免疫沉淀法測(cè)收集的洗脫液中的125I-αBtx結(jié)合活性。
　　【結(jié)果】成功純化出有較強(qiáng)125I-αBtx-nAChR結(jié)合抑制活性的眼鏡蛇α-神經(jīng)毒（Cobra VⅡc），但較天然的α-銀環(huán)蛇毒素弱，其分子量約為7 kDa；在濃度為0.18μg/0.5ml體系中，純化的α-神經(jīng)毒125I-αBtx-nAChR結(jié)合抑制率約為