梅毒螺旋體黏附素Tp0751抗原表位的預(yù)測與鑒定.pdf

1、目的：篩選和鑒定梅毒螺旋體(Treponema pallidum, Tp)粘附素Tp0751潛在的B表位、Th表位或聯(lián)合Th-B表位，為Tp多價(jià)表位疫苗的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和基礎(chǔ)。
　　方法：
　?。?） Tp0751蛋白抗原表位預(yù)測：從Genbank查獲Tp0751蛋白的氨基酸序列，運(yùn)用SYFPEITHI、HLAPrep、IEDB等軟件分析該蛋白的HLA-II類限制性Th細(xì)胞表位；利用EMBOSS和IEDB等在線軟件分析

2、該段氨基酸親水性、β-轉(zhuǎn)角、抗原性、表面可及性等特性，綜合分析預(yù)測Tp0751蛋白的B表位；以上結(jié)果重疊部分預(yù)測為聯(lián)合B-Th細(xì)胞表位。
　?。?） Tp0751蛋白抗原表位多肽人工合成與鑒定：反相高效液相色譜(RP—HPLC)人工合成和純化預(yù)測的表位多肽，質(zhì)譜分析鑒定合成的多肽。
　?。?） Tp0751蛋白原核表達(dá)與抗原性鑒定：構(gòu)建pET28a(+)/Tp0751的原核表達(dá)重組載體(不含信號(hào)肽氨基酸編碼序列)，經(jīng)雙酶切、

3、PCR和測序鑒定后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)表達(dá)菌誘導(dǎo)表達(dá)；Western blot和SDS-PAGE分別鑒定經(jīng)Ni-NTA純化的目的蛋白的抗原性和表達(dá)形式；以Ni-NTA親和層析法純化目的蛋白，BCA法測定蛋白濃度。
　?。?）兔血清與脾細(xì)胞制備及重組蛋白免疫性測定：將重組Tp0751經(jīng)皮下注射新西蘭兔共5次，分別收集血清，以重組蛋白檢測抗體效價(jià)，鑒定其免疫原性，并用于Tp0751的B細(xì)胞表位鑒定；末次免疫后第10天

4、，采集兔脾細(xì)胞，用于Tp0751的Th細(xì)胞表位鑒定。
　?。?） Tp0751的B細(xì)胞表位鑒定：分別以預(yù)測為B/B-Th表位的合成多肽和重組表達(dá)蛋白為包被抗原包被微孔板，梅毒陽性病人血清和免疫兔血清為一抗，同時(shí)設(shè)立陰性對照組，間接ELISA法檢測鑒定預(yù)測的Tp0751 B細(xì)胞表位或聯(lián)合B-Th細(xì)胞表位。
　?。?） Tp0751的Th細(xì)胞表位鑒定：以預(yù)測為T/Th-B表位的合成短肽刺激培養(yǎng)兔脾細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立ConA和重組Tp

5、0751全蛋白刺激組為陽性對照，PBS刺激組為陰性對照， CCK-8法檢測刺激兔脾細(xì)胞的增殖水平， Realtime-PCR測定IL-4和INF-γmRNA水平，鑒定Th細(xì)胞表位。
　　結(jié)果：
　?。?） Tp0751蛋白抗原表位預(yù)測：分析總結(jié)在線軟件預(yù)測出P1(65-83AA)、P2(90-101AA)、P3(127-137AA)、P4(221-237AA)、P5(175-185AA)為Tp0751候選B細(xì)胞表位

6、；P5(175-185AA)、P6(103-113AA)、P7(162-171AA)為候選Th細(xì)胞表位；P5(175-185AA)為候選聯(lián)合Th-B表位。
　?。?）人工合成多肽：質(zhì)譜檢測合成多肽相對分子質(zhì)量，測定值與理論值相符；RP-HPLC法測定各合成多肽的純度均達(dá)90％以上，滿足實(shí)驗(yàn)要求。
　?。?） Tp0751蛋白表達(dá)及其抗原性與免疫原性鑒定：酶切及測序鑒定證實(shí)重組質(zhì)粒pET28a(+)/Tp0751插入片段序列與

7、GenBank登錄序列完全一致；可溶性表達(dá)約26kDa大小重組蛋白，純化后純度達(dá)95%以上；Western blot顯示，重組蛋白僅與梅毒陽性病人血清產(chǎn)生特異性反應(yīng)；ELISA檢測免疫兔血清抗Tp0751效價(jià)均在1:12000以上。
　?。?） Tp0751的B細(xì)胞表位鑒定：ELISA結(jié)果顯示，預(yù)測表位P4、P5與梅毒患者血清、免疫兔血清均呈陽性反應(yīng)，而與健康人血清不反應(yīng)。
　　（5） Tp0751的Th細(xì)胞表位鑒定：CCK