博爾納病病毒核蛋白抗體ELISA檢測方法的構(gòu)建.pdf

1、目的： 擬建立博爾納病病毒（BDV）核蛋白血清學抗體檢測方法，為BDV大規(guī)模篩查提供快速、簡便、經(jīng)濟、準確的手段，亦為博爾納病病毒核蛋白作用機制研究提供支持。 方法： 1、根據(jù)BDV P40基因序列設計引物，擴增BDV P40基因后構(gòu)建重組質(zhì)粒。鑒定篩選正確后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，表達BDV重組核蛋白，親和層析技術(shù)純化該蛋白后，SDS-PAGE分析其表達量及純度，Bradford法鑒定蛋白表達量，Western-b

2、lot法鑒定重組蛋白免疫原性，質(zhì)譜法鑒定表達蛋白分子量及成分。 2、辣根過氧化物酶（HRP）標記重組BDV核蛋白，為后期行雙抗原ELISA檢測抗體方法提供酶標抗原。 3、將重組BDV核蛋白作為免疫原免疫新西蘭大白兔，得到兔抗-BDV核蛋白多克隆抗體。 4、重組BDV核蛋白作為包被抗原，辣根過氧化物酶標記的重組BDV核蛋白作為酶標抗原，初步建立了雙抗原夾心BDV血清抗體ELISA檢測法，并檢測其有效性。 結(jié)

3、果： 1、成功構(gòu)建了可用于BDV核蛋白基因表達的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定及核酸序列分析驗證正確。 2、成功的在大腸桿菌中表達了BDV重組核蛋白。重組蛋白具有較高的純度和良好的免疫原性。SDS-PAGE分析表明，經(jīng)過親和層析后E.coli中表達的重組蛋白純度可達90％；WB分析表明，重組博爾納病病毒核蛋白具有良好的免疫原性；質(zhì)譜鑒定，表明重組博爾納病病毒核蛋白與天然博爾納病病毒核蛋白結(jié)構(gòu)一致。 3、驗證了重組核

4、蛋白與抗體之間具有特異性結(jié)合能力，說明重組蛋白可以作為包被抗原使用。ELISA法確定重組BDV核蛋白與單克隆抗體具有隨稀釋濃度改變的特異性結(jié)合能力，但與其它抗體則無此量效關(guān)系。 4、初步建立了博爾納病病毒核蛋白抗體雙抗原夾心ELISA檢測法，測定了最佳抗原包被濃度及最佳酶標抗原濃度等參數(shù)。 結(jié)論： 1、重組BDV核蛋白與天然的BDV病毒核蛋白具有一致的免疫原性與結(jié)合力，可用于替代天然BDV病毒核蛋白用于ELISA