基于PD-1-PD-L1信號通路研究補腎清毒法治療CHB的作用機制.pdf

1、研究目的:
　　通過研究HBV感染患者PD-1/PD-L1信號通路的變化及補腎清毒法對其的影響，探討HBV免疫耐受的作用途徑以及補腎清毒法抗HBV可能的作用靶點和機制，闡明補腎清毒法治療CHB的免疫活化機制，以及HBV持續(xù)感染免疫逃逸與中醫(yī)伏氣理論“腎虛邪伏肝血”病機的關(guān)系，揭示慢性乙肝伏氣病機的本質(zhì)，為補腎清毒法治療CHB提供較為全面的科學(xué)依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.將39例符合納入標(biāo)準(zhǔn)的慢性乙型肝炎患者隨機分為

2、中西藥治療和西藥治療組。中西藥治療組20例，西藥治療組19例，納入10例健康志愿者作為正常組。中西藥治療組服用補腎清毒方藥和核苷酸類似物，西藥組口服核苷酸類似物。分別在治療前和治療6個月后通過流式細(xì)胞檢測術(shù)檢測健康獻血者及CHB患者外周血CTL(CD8+T)表面分子PD-1、PD-L1的表達。
　　2.通過CCK8法對腫瘤細(xì)胞(CEMX174)進行細(xì)胞毒性檢測，確定補腎清毒方藥的最高無毒濃度。
　　3.采集CHB患者以及健康

3、志愿者外周靜脈血20ml，分離PBMC，在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中以R10培養(yǎng)基培養(yǎng)，以rhGM-CSF，rhIL-4，rhTNF-α和IL-1β刺激誘導(dǎo)PBMC分化為DC，待檢測成熟后，加入補腎清毒方最高無毒濃度混合培養(yǎng)48h。以流式細(xì)胞儀分別檢測DC細(xì)胞表面分子CD80、CD86、PD-L1、PD-L2的變化。
　　4.采集CHB患者以及健康志愿者外周靜脈血10ml，分離PBMC，然后以磁珠法分離CD8+T細(xì)胞和CDKT細(xì)胞，然后在2

4、4孔細(xì)胞培養(yǎng)板中以R20培養(yǎng)基培養(yǎng)，以PHA、IL-2培養(yǎng)擴增，加入補腎清毒方最高無毒濃度混合培養(yǎng)48h。以流式細(xì)胞儀分別檢測CD8+T細(xì)胞表面分子CD28、CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2的變化。
　　研究結(jié)果:
　　1.正常人及CHB患者外周血CTL(CD8+T)表面分子PD-1、PD-L1的表達
　　治療前CHB患者外周血PBMC細(xì)胞上PD-1和PD-L1的表達百分率均比正常人高。其中治療前慢性病毒

5、性乙型肝炎的患者外周PBMC表面分子PD-L1在T細(xì)胞CD8+細(xì)胞及非T細(xì)胞CD8+細(xì)胞上的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義的(P＜0.05)。
　　治療24周后，中西藥治療組及西藥治療組CHB患者CD8+T細(xì)胞上PD-1的表達水平較治療前上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);西藥治療組的PD-1上升幅度小于中西藥治療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　治療24周后，中西藥治療組及西藥治療組CHB患者CD8+T細(xì)胞上PD-L1

6、的表達水平較治療前下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.CEMX174腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞藥物毒性實驗CCK-8法研究結(jié)果提示:補腎清毒方藥最高無毒濃度是1∶20即0.125mg/ml。
　　3.體外培養(yǎng)系統(tǒng)中樹突狀細(xì)胞(DC)表達共刺激分子CD80、CD86、PD-L1、PD L2的表達
　　成熟樹突狀細(xì)胞鏡下觀察結(jié)果:在倒置顯微鏡下能夠見到胞體較前變大，胞體體表長有像毛發(fā)一樣的觸角，整個孕育發(fā)展的形式是以DC

7、細(xì)胞的半懸浮形式生長的，從形態(tài)變化和生長狀態(tài)角度，都符合典型樹突狀細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點。
　　健康人未加藥的成熟樹突狀細(xì)胞與CHB患者未加藥的成熟樹突狀細(xì)胞比較，健康人成熟樹突狀細(xì)胞表達的共刺激分子CD80、CD86、PD-L2的表達較CHB患者高，PD L1的表達較CHB患者低，其中CD80、CD86表達差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，PD-L2表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，PD-L1表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)

8、;CHB患者加藥的成熟樹突狀細(xì)胞與健康人未加藥的成熟樹突狀細(xì)胞比較，CHB患者成熟樹突狀細(xì)胞表達的共刺激分子CD80、CD86、PD-L2比健康人低，PD L1比健康人高，但是差距減少，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　健康人加藥后的成熟樹突狀細(xì)胞與未加藥的比較，加藥后的成熟樹突狀細(xì)胞表達的共刺激分子CD80、CD86、PD-L1的表達較未加藥組下調(diào)，PD-L2的表達較未加藥組上調(diào)，其中CD80、CD86、PD-L2表達差異

9、有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，PD-L1表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　CHB患者加藥后的成熟樹突狀細(xì)胞與未加藥的比較，加藥后的成熟樹突狀細(xì)胞表達的共刺激分子CD80、CD86及PD-L2的表達均上調(diào)、PD-L1表達下調(diào)，其中CD80、CD86、PD L2表達差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，PD-L1表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.體外培養(yǎng)系統(tǒng)中CD8+T細(xì)胞表達共刺激分子CD80、CD

10、86、PD-1、PD L1、PD-L2的表達健康人未加藥的CD8+T細(xì)胞與CHB患者未加藥的CD8+T細(xì)胞比較，健康人CD8+T細(xì)胞上表達的共刺激分子CD28、PD-L2的表達水平較CHB患者高，CTLA-4、PD-1、PD-L1的表達水平比CHB患者低，其中PD-L1的差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，CHB患者加藥的CD8+T細(xì)胞與健康人未加藥的CD8+T細(xì)胞比較，健康人CD8+T細(xì)胞上表達的共刺激分子CD28、PD-L2的表達

11、水平仍較CHB患者高，CTLA-4、PD-1、PD-L1的表達水平仍比CHB患者低，但是差距減少，其中PD-L1表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　健康人加藥的CD8+T細(xì)胞與未加藥的比較，加藥的CD8+T細(xì)胞上表達共刺激分子CD28、PD-L1、PD-L2表達下調(diào)，CTLA-4、PD1表達上調(diào)，其中CD28、PD-L2的表達差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　CHB患者加藥的CD8+T細(xì)胞與未加藥的比較，加

12、藥的CD8+T細(xì)胞上表達共刺激分子CD28、PD-L2表達水平上調(diào)，CTLA-4、PD-1及PD-L1表達水平下調(diào)，但是差異無統(tǒng)計意義(P＞0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　1.機體感染乙肝病毒(HBV)后，外周血淋巴細(xì)胞上PD-1、PD-L1表達水平高于正常人。經(jīng)治療24周后，中西藥組和西藥組CD8+T細(xì)胞上PD-1的表達水平上調(diào)，西藥組上升幅度低于中西藥組;CD8+T細(xì)胞上PD-L1的表達水平下調(diào)。表明補腎清毒方治療CH

13、B的作用可能通過調(diào)節(jié)PD-1/PD-L1信號通路影響免疫耐受而達到治療CHB的目的。
　　2.體外誘導(dǎo)培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞(DC)和補腎清毒湯藥最高無毒濃度混合培養(yǎng)。補腎清毒方藥使CHB患者成熟DC細(xì)胞表達共刺激分子CD80、CD86及PD-L2的表達水平上調(diào)、PD-L1表達水平下調(diào)。補腎清毒方可能是通過上調(diào)CHB患者成熟DC細(xì)胞表達共刺激分子CD80、CD86及PD-L2表達水平，抑制PD-L1表達水平達到治療CHB的作用。