PD-1-PD-L信號(hào)在ITV全蟲疫苗誘導(dǎo)免疫性保護(hù)中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、經(jīng)過長期不懈的努力，瘧疾在全球的發(fā)病率和死亡人數(shù)都有一定程度的下降，但是瘧疾仍然是世界上危害最為嚴(yán)重的三大傳染病之一。在瘧疾的防治措施中，紅內(nèi)期疫苗是最經(jīng)濟(jì)有效的方式之一。雖然研究人員對(duì)紅內(nèi)期疫苗進(jìn)行了深入的研究，然而迄今為止，仍然沒有一種有效的紅內(nèi)期疫苗應(yīng)用于臨床。目前的研究認(rèn)為，瘧原蟲抗原高變異性及裂殖子表面蛋白多態(tài)性是紅內(nèi)期亞單位疫苗研制過程中存在的主要問題。近來研究表明，紅內(nèi)期ITV全蟲疫苗可以通過誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生高滴度瘧原蟲特異性

2、抗體，從而為宿主提供完全性免疫保護(hù)，這為紅內(nèi)期亞單位疫苗的成功研制提供了新的思路。然而，關(guān)于紅內(nèi)期全蟲疫苗中瘧原蟲特異性B細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活化機(jī)制尚不清楚。
　　PD-1/PD-L信號(hào)作為天然免疫系統(tǒng)中十分重要的負(fù)性調(diào)節(jié)成份，最近的研究表明，其在調(diào)節(jié)濾泡樣輔助性T細(xì)胞(CD4+ follicular helper T cell TFH)活化GC B細(xì)胞抗體分泌中發(fā)揮著十分重要的作用。同時(shí)，在瘧疾感染免疫過程中，PD-1/PD-L信號(hào)缺

3、失能增強(qiáng)TFH細(xì)胞活化B細(xì)胞抗體分泌的能力。然而，PD-1/PD-L信號(hào)在ITV全蟲疫苗誘導(dǎo)GC B細(xì)胞活化中的作用還不清楚。
　　在本研究中，我們首先確認(rèn)PD-1/PD-L信號(hào)是否在紅內(nèi)期ITV全蟲疫苗中發(fā)揮作用，并采用過繼轉(zhuǎn)移及體內(nèi)耗竭實(shí)驗(yàn)證實(shí)是抗體還是CD4+T細(xì)胞參與免疫保護(hù)過程。其次，我們對(duì)兩種免疫小鼠血清瘧原蟲特異性抗體滴度及脾臟GC B細(xì)胞頻率進(jìn)行檢測。然后，我們通過檢測兩種免疫小鼠血清炎癥因子濃度及脾臟TFH細(xì)胞頻

4、率，并采用反向拮抗實(shí)驗(yàn)，找到影響PD-1-/-免疫小鼠GC B細(xì)胞功能的主要原因。最后，通過檢測兩種免疫小鼠脾臟TFR細(xì)胞和CXCR5+-DC頻率，初步探討影響紅內(nèi)期ITV全蟲疫苗TFH細(xì)胞功能的機(jī)制。
　　一、PD-1缺失顯著增強(qiáng)紅內(nèi)期ITV全蟲疫苗誘導(dǎo)小鼠的保護(hù)性免疫力
　　1.構(gòu)建約氏瘧原蟲17XL紅內(nèi)期ITV全蟲疫苗模型
　　Balb/c小鼠尾靜脈感染約氏瘧原蟲17XL后，連續(xù)腹腔注射氯喹(Chloroquin

5、e CQ)15天。在停藥休息21天后，腹腔注射P.y17XL iRBC進(jìn)行攻擊并觀察免疫保護(hù)效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未免疫WT小鼠相比，免疫小鼠雖然在攻擊后第四天，出現(xiàn)原蟲血癥，并在第六天達(dá)到峰值，但最終其獲得了完全性免疫保護(hù)。
　　2.PD-1-/-增強(qiáng)小鼠紅內(nèi)期ITV全蟲疫苗的保護(hù)性:采用P.y17XL iRBC攻擊WT和PD-1-/-兩種免疫小鼠，觀察小鼠的原蟲血癥及存活率，發(fā)現(xiàn)與正常免疫小鼠相比，PD-1-/-免疫小鼠免疫保護(hù)效

6、果明顯高于WT免疫小鼠，這說明PD-1/PD-L信號(hào)在紅內(nèi)期ITV全蟲疫苗中發(fā)揮著重要的作用。
　　二、PD-1缺失通過影響GCB細(xì)胞瘧原蟲特異性抗體的分泌，從而增強(qiáng)P.y17XL紅內(nèi)期ITV全蟲疫苗誘導(dǎo)小鼠的免疫性保護(hù)力
　　1.P.y17XL紅內(nèi)期ITV全蟲疫苗主要依賴瘧原蟲特異性抗體提供保護(hù):WT小鼠免疫停藥后第三周，分離其血清并過繼至正常未免疫小鼠，在用P.y17XL iRBC攻擊后，觀察其原蟲血癥及存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)

7、，與未過繼免疫小鼠血清組相比，免疫小鼠血清過繼組其原蟲血癥顯著降低，并最終獲得免疫保護(hù)。同時(shí)，體內(nèi)耗竭末次免疫停藥三周WT小鼠體內(nèi)CD4+T細(xì)胞，并用P.y17XL iRBC進(jìn)行攻擊。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未耗竭組免疫小鼠相比，CD4+T細(xì)胞耗竭WT免疫小鼠原蟲血癥沒有顯著變化，這說明P.y17XL紅內(nèi)期ITV全蟲疫苗主要依賴于瘧原蟲特異性抗體發(fā)揮保護(hù)作用。
　　2.PD-1-/-全蟲免疫小鼠主要通過提高血清瘧原蟲特異性抗體滴度，從而增強(qiáng)免

8、疫保護(hù)效果:分離末次免疫停藥后三周小鼠血清，進(jìn)行瘧原蟲特異性抗體檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然兩種免疫小鼠血清IgG1滴度之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但PD-1-/-免疫小鼠血清IgG和IgG2a滴度明顯高于WT免疫小鼠。同時(shí)，將兩種免疫小鼠血清過繼轉(zhuǎn)移至正常未免疫小鼠，在用P.y17XL iRBC攻擊后，發(fā)現(xiàn)PD-1-/-免疫小鼠血清過繼組其原蟲血癥顯著低于WT免疫小鼠過繼組，這說明PD-1-/-紅內(nèi)期ITV全蟲疫苗主要是通過增強(qiáng)瘧原蟲特異性抗體的分泌，

9、從而增強(qiáng)免疫保護(hù)。
　　3.GCB細(xì)胞頻率及數(shù)量的增多是PD-1缺失小鼠保護(hù)力增強(qiáng)的重要原因:分離末次免疫停藥后第7天、9天、11天、14天以及21天小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，流式檢測GC B細(xì)胞頻率并統(tǒng)計(jì)其總細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間推移，兩種免疫小鼠脾臟GC B細(xì)胞的頻率及總數(shù)均逐步增多。但是，PD-1-/-免疫小鼠GC B細(xì)胞頻率及總數(shù)增長的幅度明顯高于WT免疫小鼠，這提示PD-1-/-免疫小鼠可以通過促進(jìn)GC B細(xì)胞活化，增強(qiáng)瘧原

10、蟲特異性抗體分泌，從而加強(qiáng)免疫保護(hù)效果。
　　三、PD-1缺失通過增強(qiáng)血清炎癥因子分泌及脾臟TFH細(xì)胞活化，從而促進(jìn)GC B細(xì)胞瘧原蟲特異性抗體分泌
　　1.PD-1-/-免疫小鼠脾臟TFH細(xì)胞頻率和數(shù)量以及血清炎癥因子(IFN-γ、IL-10、MCP-1)濃度均顯著升高:分離末次免疫停藥后第7天、9天、11天、14天以及21天小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，流式檢測TFH細(xì)胞頻率并統(tǒng)計(jì)其總的數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與GC B細(xì)胞變化趨勢不同的是

11、，脾臟TFH細(xì)胞頻率及總的數(shù)目在免疫停藥后第7天達(dá)到最高，然后隨著時(shí)間的推移逐步降低。與WT免疫小鼠相比，PD-1-/-免疫小鼠脾臟TFH細(xì)胞頻率及細(xì)胞數(shù)目均明顯升高。同時(shí)，對(duì)免疫停藥后21天小鼠血清炎癥因子進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，IFN-γ、 IL-10、MCP-1這三種炎癥因子在PD-1-/-免疫小鼠血清中的濃度均顯著高于WT免疫小鼠。以上結(jié)果均提示，PD-1-/-全蟲疫苗免疫小鼠可能是通過增強(qiáng)脾臟TFH細(xì)胞活化及血清相關(guān)炎癥因子濃度，從而對(duì)

12、GC B細(xì)胞瘧原蟲特異性抗體的分泌進(jìn)行調(diào)節(jié)。
　　2.分別反向拮抗PD-1-/-全蟲疫苗免疫小鼠血清炎癥因子IFN-γ、IL-10、MCP-1均能降低脾臟GC B細(xì)胞頻率和數(shù)目:PD-1-/-小鼠免疫停藥后第1天、3天、5天或者第3天、5天、7天、9天以及11天腹腔分別注射IFN-γ、IL-10、MCP-1三種細(xì)胞因子的拮抗抗體，并于停藥后第7天或14天分別檢測總淋巴細(xì)胞數(shù)目、GC B細(xì)胞頻率及數(shù)目的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未拮抗免疫組

13、相比，三組拮抗組小鼠在免疫停藥后第7天，其淋巴細(xì)胞總數(shù)、GC B細(xì)胞頻率及數(shù)目均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而在免疫停藥后第14天檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，三組拮抗小鼠其脾臟淋巴細(xì)胞總數(shù)、GC B細(xì)胞頻率及數(shù)目較未拮抗免疫組均有顯著下降，這提示這三種炎癥因子可能維持了脾臟GC B細(xì)胞的存活。
　　四、PD-1缺失促進(jìn)紅內(nèi)期ITV全蟲疫苗脾臟TFH細(xì)胞活化機(jī)制的初步探討1.PD-1-/-免疫小鼠脾臟TFH細(xì)胞活化并不依賴于血清炎癥因子IFN-γ、IL-10以

14、及MCP-1:PD-1-/-小鼠免疫停藥后第1天、3天、5天或者第3天、5天、7天、9天以及11天腹腔分別注射IFN-γ、 IL-10、MCP-1三種細(xì)胞因子的拮抗抗體，并于停藥后第7天或14天分別檢測脾臟TFH細(xì)胞頻率及數(shù)目的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是免疫停藥后第7天或14天，細(xì)胞因子拮抗組與未拮抗組在TFH細(xì)胞頻率及數(shù)目上均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這提示血清炎癥因子IFN-γ、IL-10以及MCP-1可能不參與PD-1-/-紅內(nèi)期ITV免疫小鼠

15、TFH細(xì)胞的調(diào)節(jié)。
　　2.PD-1-/-免疫小鼠脾臟TFH細(xì)胞功能的增強(qiáng)可能并不依賴于DC活化:小鼠免疫后第2天、4天、6天，分離其脾臟淋巴細(xì)胞并檢測CXCR5+ DC表面共刺激分子表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然三種共刺激分子CD86、MHC-Ⅱ、CD40在兩種免疫小鼠均有不同程度的活化，但它們之間卻沒有明顯的差別，這提示PD-1-/-免疫小鼠TFH細(xì)胞數(shù)量的增多可能與DC細(xì)胞初始的活化關(guān)系不大。
　　3.PD-1-/-免疫小鼠脾臟

16、TFH細(xì)胞活化并不依賴于脾臟TFR細(xì)胞功能:分離免疫停藥后第7天、14天以及21天小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，流式檢測脾臟TFR細(xì)胞頻率的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然兩種免疫小鼠在免疫停藥后第14天，TFR細(xì)胞頻率均顯著下降，但是無論是Naive還是PD-1-/-免疫小鼠，其脾臟TFR細(xì)胞頻率均比相應(yīng)WT小鼠要高。這提示我們，PD-1-/-免疫小鼠TFH細(xì)胞功能可能不是受TFR細(xì)胞所調(diào)節(jié)。
　　本研究成功建立了P.y17XL紅內(nèi)期ITV全蟲疫苗模型

17、，利用該模型我們發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L信號(hào)通過影響脾臟GC B細(xì)胞瘧原蟲特異性抗體的分泌，從而在紅內(nèi)期全蟲疫苗中發(fā)揮重要作用，而PD-1缺失免疫小鼠脾臟GC B細(xì)胞的功能與血清炎癥因子及TFH細(xì)胞密切相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PD-1缺失免疫小鼠脾臟TFH細(xì)胞活化并不依賴于CXCR5+ DC、血清炎癥因子(IFN-γ、IL-10、MCP-1)以及TFR細(xì)胞功能。本研究首次證實(shí)了PD-1/PD-L信號(hào)在紅內(nèi)期ITV全蟲疫苗有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生保護(hù)性