PD-L1-IgG1融合蛋白維持DC未成熟狀態(tài)在誘導(dǎo)心臟移植免疫耐受中的效應(yīng)與機制研究.pdf

1、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)是一類功能強大，并且是唯一能夠激活初始T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞，在識別和提呈抗原、啟動免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)移植排斥反應(yīng)中起著重要的作用。由于DC是一類異質(zhì)性細(xì)胞群體，具有不同的亞群和不同的功能狀態(tài)，不但在增強免疫反應(yīng)上具有重要的作用，也具有抑制排斥反應(yīng)、誘導(dǎo)特異性免疫耐受的潛力。有研究表明，未成熟DC缺乏共刺激分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的表達(dá)，體外能夠誘導(dǎo)同種抗原特異性的T細(xì)胞

2、失能。體內(nèi)未成熟DC存在著自然發(fā)育成熟的內(nèi)在機制，而且器官移植術(shù)后受者體內(nèi)產(chǎn)生的多種介質(zhì)，如致炎性細(xì)胞因子、LPS等，均能促進(jìn)DC分化成熟，使之擁有強大的免疫原性。因此，一些調(diào)控手段，如免疫抑制分子1，25-二羥維生素D共培養(yǎng)或白細(xì)胞介素10(interleukin10，IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming factorβ，TGF-β)等修飾，可以使DC維持于穩(wěn)定的未成熟狀態(tài)，增強其耐受原性，是減輕移植排斥反應(yīng)、誘導(dǎo)特

3、異性免疫耐受的重要途徑并具有潛在的臨床應(yīng)用價值。
　　根據(jù)多個實驗室的研究報道，PD-L1對T細(xì)胞反應(yīng)的影響有共刺激和抑制兩種作用情況，具體機理尚未完全闡明，目前尚有爭議性。已有學(xué)者指出T細(xì)胞受刺激活化5～15分鐘后，B7-H1和B7-DC先與其第二未明活化受體結(jié)合，上調(diào)T細(xì)胞表面CD40L的表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞的進(jìn)一步活化;而24小時后，T細(xì)胞開始表達(dá)PD-1，PD-L/ PD-1途徑占主導(dǎo)作用，介導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡并下調(diào)細(xì)胞因子的分泌

4、，對T細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。PD-L1/PD-1共刺激途徑可抑制T細(xì)胞受體介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和細(xì)胞因子分泌，B7-H1缺陷鼠的表型亦表明B7-H1在體內(nèi)有重要的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。PD-L1/PD-1通路在移植免疫中起著重要作用。PD-L1/PD-1通路可抑制移植動脈病(graft arterial disease，GAD)。也有研究表明，PD-L1/PD-1通路提供給T細(xì)胞信號，影響著急性移植物抗宿主病(graft-vs-host d

5、isease，GVHD)的致死率。
　　鑒于PD-L1對DC發(fā)育及免疫功能的重要調(diào)控作用，我們設(shè)想采用新型基因工程技術(shù)致敏未成熟DC，將會減緩或阻止DC的成熟過程，體內(nèi)回輸有利于減輕排斥反應(yīng)，并可能誘導(dǎo)穩(wěn)定、有效的供者特異性免疫耐受。
　　本研究通過構(gòu)建高表達(dá)mPD-L1-IgG1融合蛋白的酵母菌株，純化制備mPD-L1-IgG1融合蛋白;體外培養(yǎng)、擴(kuò)增并富集小鼠骨髓來源的DC，采用融合蛋白致敏未成熟DC，研究mPD-L1-

6、IgG1致敏的未成熟DC的表型及功能的變化，以及體外誘導(dǎo)同種抗原特異性T細(xì)胞低反應(yīng)性的作用和效果;通過建立小鼠同種異體異位心臟移植模型，觀察mPD-L1-IgG1-DC體內(nèi)減輕排斥反應(yīng)、誘導(dǎo)心臟移植免疫耐受的效果，并探討了可能的機制。
　　第一部分 酵母表達(dá)的PD-L1-IgG1融合蛋白表達(dá)、純化和鑒定
　　一、酵母表達(dá)mPD-L1/mIgG1Fc工程菌的構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建高表達(dá)mPD-L1/mIgG1Fc的酵母工程

7、菌。
　　方法:將mPD-L1基因與mIg基因依次定向克隆入酵母pPIC9k載體構(gòu)建pPIC9k-mPD-L1-Ig融合基因表達(dá)質(zhì)粒;以表達(dá)質(zhì)粒電穿孑L酵母感受態(tài)菌GS115，經(jīng)MD板營養(yǎng)篩選、和G418+抗性篩選高拷貝酵母菌株。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了高表達(dá)PD-L1-IgG1融合蛋白的酵母菌株。
　　結(jié)論:構(gòu)建了mPD-L1/mIgG1Fc酵母表達(dá)的工程菌，為下一步蛋白純化研究打下了良好基礎(chǔ)。
　　二、mPD-

8、L1-mIgG1-Fc融合蛋白的表達(dá)與純化研究
　　目的:將成功構(gòu)建了高表達(dá)PD-L1-IgG1融合蛋白的酵母菌株進(jìn)行純化、鑒定。
　　方法:探索不同誘導(dǎo)時間和溶解氧含量對融合蛋白發(fā)酵表達(dá)產(chǎn)量的影響;探索和優(yōu)化酵母上清中融合蛋白的各種純化制備條件;建立新型融合蛋白的鑒定方法。
　　結(jié)果:確定了酵母菌株的發(fā)酵條件是發(fā)酵72小時，甲醇誘導(dǎo)濃度是8ml/h，優(yōu)化了融合蛋白的純化方法，建立了mPD-L1-Ig融合蛋白的純化流程

9、，最終獲得了純度＞95％的mPD-L1-IgG1融合蛋白，內(nèi)毒素含量低于0.03pg/μg蛋白。
　　結(jié)論:制備了符合生物學(xué)功能實驗要求的mPD-L1-Ig融合蛋白，為進(jìn)一步開展功能研究打下了良好基礎(chǔ)。
　　第二部分 PD-L1-IgG1融合蛋白維持DC未成熟狀態(tài)和低反應(yīng)性
　　目的:建立PD-L1-IgG1融合蛋白致敏DC方法，研究融合蛋白維持DC未成熟狀態(tài)和誘導(dǎo)DC低反應(yīng)性的能力。
　　方法:用mPD-L1-

10、IgG1融合蛋白致敏體外擴(kuò)增的第5天的BALB/c小鼠骨髓來源的未成熟DC，流式細(xì)胞儀檢測LPS刺激前后致敏DC的表型改變;將BALB/c來源的LPS-DC、imDC和mPD-L1-IgG1-DC，以不同比例與C57BL/6小鼠來源的T細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)，并檢測反應(yīng)上清中細(xì)胞因子的含量;將BALB/c小鼠來源的imDC和mPD-L1-IgG1致敏DC分別經(jīng)尾靜脈注入C57BL/6小鼠體內(nèi)（2×106細(xì)胞/只），7天取受者

11、脾臟，檢測受者脾臟T細(xì)胞與供者和無關(guān)第三者脾臟淋巴細(xì)胞的MLR情況。
　　結(jié)果:致敏DC表面高表達(dá)mPD-L1-IgG1融合蛋白，致敏DC能有效抵抗LPS刺激而維持未成熟狀態(tài)，其表面CD80、CD86及HLA-DR等分子的表達(dá)下調(diào);MLR反應(yīng)中致敏DC刺激同種異基因T細(xì)胞增殖的能力顯著低于對照組，分泌Th1因子(IL-2、IFN-γ)顯著下降， Th2因子(IL-4、TGF-β)則明顯上升;致敏DC免疫組脾臟T淋巴細(xì)胞接觸供者抗原

12、時，表現(xiàn)出明顯的低反應(yīng)性。
　　結(jié)論: mPD-L1-IgG1能有效致敏未成熟DC，維持DC表型和功能保持未成熟狀態(tài)，誘導(dǎo)DC低反應(yīng)性。
　　第三部分 小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)模型的建立
　　目的:建立可用于移植急性排斥反應(yīng)研究的小鼠心臟移植模型。
　　方法:實驗組的供、受體分別來自BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠;對照組的供、受體來自BALB/c小鼠，每組各20對。采用Cuff血管吻合技術(shù)，在小鼠頸部進(jìn)行異

13、位心臟移植。心臟移植術(shù)后第7天，每組10只取移植心臟組織，用石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色，進(jìn)行組織病理學(xué)分析。觀察每組其余存活受體小鼠的移植心臟存活期。
　　結(jié)果:手術(shù)成功率達(dá)92.5％(37/40)。移植后第7天病理組織檢查結(jié)果顯示:實驗組排斥反應(yīng)等級為3.55±0.44，對照組為0.40±0.32，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。實驗組移植心臟存活(8.22±0.67)d，對照組移植心臟存活＞100 d，兩組比較

14、差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:采用Cuff血管吻合技術(shù)，將BALB/c小鼠心臟移植至C57BL/6小鼠，可以建立穩(wěn)定的小鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)模型。該方法手術(shù)成功率高，值得推廣。
　　第四部分 PD-L1-IgG1-DC誘導(dǎo)小鼠心臟移植免疫耐受的作用和機制
　　目的:建立PD-L1-IgG1-DC誘導(dǎo)小鼠心臟移植免疫耐受模型，探索其體內(nèi)負(fù)向免疫作用機制。
　　方法:選擇C57BL/6小鼠為受體，在

15、移植前7天，經(jīng)尾靜脈注入BALB/c小鼠來源的Day5-DC和PD-L1-IgG1-DC(2×106細(xì)胞/只)，PBS組為對照，進(jìn)行頸部異位心臟移植術(shù)，觀察各組心臟移植物的存活期;術(shù)后第7天觀察心臟移植物的病理改變，并測定體內(nèi)血清細(xì)胞因子水平;分析受者脾臟T細(xì)胞對供者抗原的刺激反應(yīng)和CTL效應(yīng)。
　　結(jié)果:PD-L1-IgG1-DC組心臟移植物平均存活天數(shù)為(24.2±3.29)d，比Day5-DC組和對照組均明顯延長(P＜0.0

16、1);致敏DC組心臟移植物的病理改變明顯輕于其它2組，血清中Th1細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ)水平較其它2組減低，而Th2細(xì)胞因子TGF-β水平升高、IL-4水平無明顯差異;PD-L1-IgG1-DC組脾臟淋巴細(xì)胞對供者抗原的刺激反應(yīng)下降明顯(P＜0.01)，其在CTL反應(yīng)中對靶細(xì)胞的殺傷活性明顯弱于Day5-DC組和對照組(P＜0.01); PD-L1-IgG1-DC免疫組小鼠體內(nèi)的CD4+CD25+Foxp3+ Treg調(diào)節(jié)性T

17、細(xì)胞顯著升高。
　　結(jié)論:PD-L1-IgG1-DC能夠有效誘導(dǎo)小鼠心臟移植的免疫耐受，具有較強的免疫負(fù)向應(yīng)答調(diào)控性能，其免疫負(fù)向調(diào)控功能主要由PD-L1誘生。
　　全文總結(jié)
　　mPD-L1-IgG1融合蛋白可以有效致敏未成熟DC，制備mPD-L1-IgG1-DC，該新型DC在體外可抑制同種異基因T細(xì)胞的增殖，并抑制Th1細(xì)胞因子產(chǎn)生;BALB/c小鼠來源的mPD-L1-IgG1-DC經(jīng)尾靜脈注入C57BL/6小鼠體

18、內(nèi)，可誘導(dǎo)受者對供者的抗原特異性低反應(yīng)性。應(yīng)用小鼠同種異體心臟異位移植模型證實，移植前7d經(jīng)尾靜脈注射mPD-L1-IgG1-DC可以有效地延長心臟移植物的存活時間，明顯地減輕移植心臟的病理改變。體內(nèi)作用機制分析表明mPD-L1-IgG1-DC可以借助PD-L1的效應(yīng)有效誘生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞從而維持機體免疫耐受狀態(tài)。本實驗研究了mPD-L1-IgG1融合蛋白致敏的DC作為致耐原誘導(dǎo)移植免疫耐受的作用，為進(jìn)一步探索用免疫負(fù)向因子調(diào)控DC亞群防