C5a-C5aR信號(hào)在紅內(nèi)期全蟲(chóng)疫苗誘導(dǎo)免疫性保護(hù)中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、瘧疾是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的熱帶傳染性疾病，在全球有著很高的發(fā)病率和致死率，而紅內(nèi)期疫苗是瘧疾防治中最經(jīng)濟(jì)有效的方式之一。雖然全世界科學(xué)家付出了極大的努力，但到目前為止，仍然沒(méi)有一種有效的紅內(nèi)期亞單位疫苗問(wèn)世。目前紅內(nèi)期亞單位疫苗存在的主要問(wèn)題在于瘧原蟲(chóng)抗原的高變異性及裂殖子表面蛋白的多態(tài)性。最近，紅內(nèi)期全蟲(chóng)疫苗被證實(shí)它能夠保護(hù)宿主抵抗多種瘧原蟲(chóng)攻擊，而且其保護(hù)作用主要由CD4+T細(xì)胞所介導(dǎo)，這也許能為紅內(nèi)期亞單位疫苗的設(shè)計(jì)提供一種新的

2、策略。然而，紅內(nèi)期全蟲(chóng)疫苗中瘧原蟲(chóng)特異性CD4+T細(xì)胞活化的具體機(jī)制仍然很不清楚。
　　 補(bǔ)體作為天然免疫系統(tǒng)十分重要的組成部分，最近的研究表明，補(bǔ)體在適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)中同樣發(fā)揮著不可替代的作用。比如，補(bǔ)體C5a通過(guò)調(diào)節(jié)DC功能間接影響CD8+T細(xì)胞活化。然而，C5a在全蟲(chóng)疫苗誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞反應(yīng)中的作用還不清楚。
　　 在本研究中，我們首先觀察紅內(nèi)期全蟲(chóng)疫苗免疫后，WT和C5aR-/-小鼠體內(nèi)補(bǔ)體活化及C5a產(chǎn)生情況

3、，并確認(rèn)C5a/C5aR信號(hào)是否在紅內(nèi)期全蟲(chóng)疫苗中發(fā)揮作用。然后我們檢測(cè)兩種小鼠免疫后體內(nèi)抗體及CD4+T細(xì)胞功能是否發(fā)生改變，并采用過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)證實(shí)是抗體還是CD4+T細(xì)胞參與免疫保護(hù)過(guò)程。最后，我們檢測(cè)兩種免疫小鼠脾臟Treg頻率及DC功能，找到影響C5aR-/-免疫小鼠CD4+T細(xì)胞功能下降的主要原因。
　　 一、C5aR缺失顯著降低全蟲(chóng)疫苗誘導(dǎo)小鼠的保護(hù)性免疫力
　　 1.觀察全蟲(chóng)疫苗免疫后，WT小鼠和C5aR-

4、/-小鼠體內(nèi)補(bǔ)體活化及C5a產(chǎn)生情況：與未免疫的正常小鼠相比，兩種免疫小鼠血清C5a含量均升高。在免疫后第二天，其濃度達(dá)到最高峰，且兩種小鼠血清C5a濃度變化趨勢(shì)基本一致。
　　 2.C5aR-/-降低小鼠紅內(nèi)期全蟲(chóng)疫苗的保護(hù)性：末次免疫后兩周，用p.y17XL pRBC攻擊免疫小鼠，觀察小鼠的原蟲(chóng)血癥及存活率，發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，兩種免疫小鼠均具有免疫保護(hù)作用。但是，C5aR-/-免疫小鼠免疫保護(hù)效果明顯低于WT免疫小鼠。這說(shuō)

5、明紅內(nèi)期全蟲(chóng)免疫能夠提供免疫保護(hù)作用，而C5a/C5aR信號(hào)在其中發(fā)揮著重要的作用。
　　 二、C5aR缺失影響DC活化CD4+T細(xì)胞功能，從而降低全蟲(chóng)疫苗誘導(dǎo)小鼠保護(hù)力
　　 1.抗體不能為紅內(nèi)期全蟲(chóng)疫苗提供保護(hù)：分離末次免疫后兩周小鼠的血清，進(jìn)行瘧原蟲(chóng)特異性抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩種小鼠血清IgG與IgG2a滴度相同。雖然WT免疫小鼠IgG1滴度比C5aR-/-免疫小鼠高一個(gè)數(shù)量級(jí)，但兩者之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。將兩種小鼠的血清

6、過(guò)繼轉(zhuǎn)移至正常未免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)并不能保護(hù)小鼠抵抗瘧原蟲(chóng)的攻擊，說(shuō)明抗體不能為紅內(nèi)期全蟲(chóng)疫苗提供保護(hù)。
　　 2.C5aR-/-小鼠CD4+T細(xì)胞的功能及記憶性T細(xì)胞的形成受到明顯抑制：分離末次免疫后兩周小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，觀察瘧原蟲(chóng)特異性CD4+T細(xì)胞增殖、IFN-γ分泌及記憶性T細(xì)胞的形成情況，發(fā)現(xiàn)免疫后敲除小鼠的脾臟瘧原蟲(chóng)特異性CD4+T細(xì)胞增殖及IFN-γ分泌能力均弱于WT小鼠，且記憶性CD4+T細(xì)胞的形成受到明顯抑制。

7、r>　　 3.CD4+T細(xì)胞功能及記憶性T細(xì)胞形成缺陷是C5aR缺失小鼠保護(hù)力下降的重要原因：分離末次免疫后兩周脾臟CD4+T細(xì)胞，將其過(guò)繼轉(zhuǎn)移至正常未免疫小鼠。在用P.y17XL pRBC攻擊后發(fā)現(xiàn)，免疫后的WT小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞能夠提供完全性保護(hù)作用，而敲除小鼠過(guò)繼轉(zhuǎn)移組小鼠最后全部死亡，說(shuō)明紅內(nèi)期全蟲(chóng)疫苗的保護(hù)效果主要是由CD4+T細(xì)胞提供，而且C5aR-/-小鼠保護(hù)力下降的重要原因在于CD4+T細(xì)胞功能及記憶性T細(xì)胞形成缺

8、陷。
　　 4.Treg可能不影響C5aR-/-免疫小鼠CD4+T細(xì)胞的功能：分離末次免疫后兩周小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，檢測(cè)Treg頻率的變化，發(fā)現(xiàn)C5aR-/-免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞Treg頻率略高于WT免疫小鼠，但兩者之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明Treg可能不影響C5aR缺失免疫小鼠CD4+T細(xì)胞的功能。
　　 5.C5aR缺失免疫小鼠脾臟DC功能顯著下降：分離初次免疫后2、4、6天小鼠脾臟DC，檢測(cè)其表面共刺激分子表達(dá)及刺激活

9、化T細(xì)胞能力，發(fā)現(xiàn)敲除小鼠DC共刺激分子CD86、MHc-Ⅱ分子表達(dá)水平以及刺激活化T細(xì)胞能力均顯著低于WT免疫小鼠，這說(shuō)明C5aR缺失能夠影響紅內(nèi)期全蟲(chóng)疫苗誘導(dǎo)小鼠DC的成熟，進(jìn)而影響CD4+T細(xì)胞的功能。
　　 6.C5a和P.y17X裂解產(chǎn)物單獨(dú)或聯(lián)合刺激均不能直接誘導(dǎo)DC的成熟：將BMDC與C5a、P.y17XL、C5a+P.y17XL分別進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)C5a和P.y17XL單獨(dú)或聯(lián)合刺激均不能誘導(dǎo)DC表面共刺激分子C

10、D86、CD40、MHc-Ⅱ分子上調(diào)，提示C5a/C5aR信號(hào)可能不是通過(guò)直接作用的方式影響全蟲(chóng)疫苗誘導(dǎo)DC成熟。
　　 本研究成功建立了紅內(nèi)期全蟲(chóng)疫苗模型，利用該模型我們發(fā)現(xiàn)C5a/C5aR信號(hào)通過(guò)影響瘧原蟲(chóng)特異性CD4+T細(xì)胞功能，從而在紅內(nèi)期全蟲(chóng)疫苗中發(fā)揮重要作用，而這一作用與DC功能的改變密切相關(guān)。本研究首次證實(shí)了C5a/C5aR信號(hào)是紅內(nèi)期全蟲(chóng)疫苗有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生保護(hù)性免疫所必需的，一定程度上揭示了紅內(nèi)期全蟲(chóng)疫苗瘧原蟲(chóng)