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1、全文分為二部分: 第一部分 Sublytic C5b-9誘導(dǎo)GMCs合成Tsp-1、TGF-β<,1>及其促細(xì)胞增殖和ECM分泌的作用 目的:探討,亞溶解劑量的補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物(sublytic C5b-9)刺激腎小球系膜細(xì)胞(Glomerular mesangial cells,GMCs)上調(diào)血小板反應(yīng)蛋白-1(Thrombospondin-1,Tsp-1)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-beta 1(Transforming g
2、rowthfactor-β<,1>,TGF-β<,1>)的基因表達(dá),促進(jìn)GMCs增殖與細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)分泌的作用。闡明Tsp-1與TGF-β<,1>、GMCs增殖和ECM分泌之間的相關(guān)關(guān)系。 方法:在確定sublytic C5b-9最佳濃度的基礎(chǔ)上,將體外培養(yǎng)的GMCs作不同的分組處理。應(yīng)用Real-time PCR和Westem blotting分別檢測(cè)不同處理的GMCs,其Tsp
3、-1、TGF-β<,1>、細(xì)胞周期蛋白(cyclin D<,2>)和纖維連接蛋白(Fibronectin,F(xiàn)N)mRNA豐度和蛋白表達(dá)水平,另用ELISA法測(cè)定GMCs培養(yǎng)上清中活化的TGF-β<,1>的含量,并用<'3>H-胸腺嘧啶核苷酸摻入量(<'3>H-thymidine incorporation,<'3>H-TdR)檢查GMCs的增殖情況。此外,利用合成的Tsp-1封閉肽段(GGWSHW,抑制TGF-β<,1>的活化),觀察T
4、sp-1在由sublytic C5b-9誘導(dǎo)TGFβ<,1>的合成、GMCs增殖與ECM分泌中的作用。 結(jié)果:培養(yǎng)的GMCs在sublytic C5b-9復(fù)合物(5%anti-Thy 1 Ab和4%正常血清)刺激后18h,其Tsp-1、TGFβ<,1>mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào),24 h時(shí)cyclin D<,2>、FN mRNA和蛋白的表達(dá)亦顯著增加,同時(shí)GMCs呈現(xiàn)明顯的增殖反應(yīng)。而GGWSHW(Tsp-1的封閉肽)能顯著
5、減少由sublytic C5b-9誘導(dǎo)的TGFβ<,1>的合成,并且FNmRNA和蛋白的表達(dá)水平也明顯下調(diào),但其對(duì)GMCs增殖影響并不顯著。 結(jié)論:Sublytic C5b-9能夠誘導(dǎo)GMCs合成Tsp-1、TGFβ<,1>,促進(jìn)GMCs增殖和ECM分泌,其ECM的分泌可能與Tsp-1、TGFβ<,1>的合成有一定的關(guān)系。 第二部分沉默Pi3-k/Akt基因?qū)ublytic C5b-9促進(jìn)GMCs合成Tsp-1,TGF
6、β<,1>及其細(xì)胞增殖和ECM分泌的影響 目的:從基因水平上探討沉默磷脂酰肌醇3-激酶(Pi3-k)/Akt基因?qū)ublytic C5b-9誘導(dǎo)Tsp-1、TGF-β<,1>的合成,促進(jìn)GMCs增殖和ECM分泌的影響。 方法:根據(jù)Pi3-k/Akt靶基因序列的不同區(qū)域設(shè)計(jì)出了8對(duì)小干涉RNA(small interference RNA,siRNA)。體外將不同的Pi3-k/Akt發(fā)夾狀RNA(small hairpi
7、n RNA,shRNA)轉(zhuǎn)染入GMCs后,篩選干擾效率最佳的Pi3-k shRNA(shPi3-k)和Akt shRNA(shAkt),將GMCs作相應(yīng)的分組處理。以Real-time PCR檢測(cè)各組GMCs中Tsp-1、TGF-β<,1>、cyclin D<,2>和FNmRNA豐度,Western blottingg檢磷酸化Akt(P<'*>-Akt),總Akt(T-Akt),Tsp-1,cyclin D<,2>和FN蛋白表達(dá)水平,另
8、用ELISA法檢測(cè)各組GMCs培養(yǎng)上清TGF-β<,1>的含量。此外,用<'3>H-TdR檢查GMCs的增殖水平。 結(jié)果:將8對(duì)shRNA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染GMCs,發(fā)現(xiàn),shPik3c3-2和shAktl-4能明顯減低GMCs中P<'*>-Akt和T-Akt的蛋白表達(dá)水平,而用shPik3c3-2、shAktl-4、shPik3c3-2+shAktl-4分別轉(zhuǎn)染GMCs,再行sublytic C5b-9刺激,其Tsp-1、TGF-β
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