亞溶解劑量補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物誘導(dǎo)GMCs增生和ECM分泌及其NF-κB活化的作用.pdf

1、目的：探討亞溶解劑量的補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物(sublyticC5b-9，SC5b-9)體外能否刺激腎小球系膜細(xì)胞(glomerularmesangialcells，GMCs)上調(diào)增殖細(xì)胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen，PCNA)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)成份-纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleantin

2、，α-SMA)的表達(dá)水平。此外，觀察SC5b-9促進(jìn)GMCs增生的同時(shí)，是否伴隨細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)的活化。 方法：(1)體外純化培養(yǎng)GMCs并經(jīng)光鏡、電鏡、細(xì)胞收縮功能實(shí)驗(yàn)(10-7mol/L血管緊張素Ⅱ，ATII)及抗肌動(dòng)蛋白(actin)抗體、抗結(jié)蛋白(desmin)抗體、抗細(xì)胞角蛋白(keratin)抗體染色鑒定。(2)采用確定的SC5b-9刺激培養(yǎng)的GMCs，實(shí)驗(yàn)設(shè)SC5

3、b-9刺激組，另設(shè)抗胸腺細(xì)胞血清(anti-thymocyteserum，ATS)組、滅活人血清組、完全營(yíng)養(yǎng)液組作為對(duì)照。用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)刺激40min時(shí)，PCNA、FNmRNA的表達(dá)，免疫組化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)40min、6h、18hPCNA、α-SMA和FN及細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65表達(dá)情況，同時(shí)應(yīng)用westernblot方法測(cè)定6h、18hFN蛋白表達(dá)，觀察SC5b-9對(duì)GMCs增生和細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響。(3)體外純培養(yǎng)的GMCs用

4、吡咯啉烷二甲基硫脲(PDTC)處理，實(shí)驗(yàn)分為三組，即SC5b-9刺激組、PDTC+SC5b-9組和完全營(yíng)養(yǎng)液組，用RT-PCR分析刺激GMCs40min后，PCNA、FNmRNA表達(dá)的變化。除此之外，還用免疫組化方法檢查18hPCNA、α-SMA和FN及細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65的表達(dá)，并用westernblot方法檢測(cè)18h時(shí)FN蛋白表達(dá)，判斷PDTC對(duì)由SC5b-9刺激介導(dǎo)的GMCs分泌ECM的抑制效應(yīng)。 結(jié)果：(1)培養(yǎng)傳代

5、的GMCs在光學(xué)顯微鏡下呈梭形。電鏡可見(jiàn)培養(yǎng)的GMCs胞漿中含有豐富的微絲結(jié)構(gòu)。在培養(yǎng)的GMCs營(yíng)養(yǎng)液中加入10-7mol/LATII，3min時(shí)即可見(jiàn)細(xì)胞發(fā)生收縮。免疫組化ABC法染色提示GMCs抗肌動(dòng)蛋白(actin)抗體和抗結(jié)蛋白(desmin)抗體染色呈陽(yáng)性，抗細(xì)胞角蛋白(keratin)抗體呈陰性。(2)SC5b-9作用后40min，PCNA和FNmRNA的表達(dá)水平明顯上調(diào)，而實(shí)驗(yàn)40min時(shí)PCNA、α-SMA及NF-κBp

6、65幾乎未見(jiàn)表達(dá)，6h時(shí)有少量細(xì)胞核和胞漿著色，18h時(shí)PCNA、α-SMA及NF-κBp65表達(dá)顯著高于ATS組、滅活人血清組、完全營(yíng)養(yǎng)液組。實(shí)驗(yàn)40min和6h，F(xiàn)N各組均有基礎(chǔ)性表達(dá)但無(wú)明顯差異；18h時(shí)，SC5b-9刺激組與其它三組相比FN明顯上調(diào)，與westernblot結(jié)果一致。(3)應(yīng)用PDTC處理，PCNA和FNmRNA表達(dá)明顯下調(diào)，18h免疫組化檢測(cè)PCNA、α-SMA及細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65表達(dá)降低，同時(shí)ECM中的