補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物對(duì)人RPE細(xì)胞膜通透性及VEGF、TGF-β2表達(dá)的影響.pdf

1、目的：補(bǔ)體系統(tǒng)激活，發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是人體抵御外來侵害的第一線，但如果反應(yīng)過度，則損傷正常組織而致病，其在老年性黃斑變性(AMD)的脈絡(luò)膜新生血管(CNV)發(fā)病中的作用越來越受關(guān)注。補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物，是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的終末產(chǎn)物，在AMD患者CNV區(qū)域的視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞表面可檢測到其存在。本研究通過觀察補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物與人RPE細(xì)胞膜結(jié)合后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變、胞漿內(nèi)鈣離子濃度變化及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(

2、TGF)-β2mRNA水平變化，探討補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物對(duì)人RPE細(xì)胞膜通透性及細(xì)胞分子生物學(xué)行為的影響，探討補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物在CNV發(fā)病中的作用。 方法：1.采用胰蛋白酶消化法培養(yǎng)人原代RPE細(xì)胞，并使用細(xì)胞角蛋白抗體免疫組織化學(xué)染色鑒定。細(xì)胞傳代至第2代一第3代用于后繼實(shí)驗(yàn)。2.采用大鼠血清接觸兔紅細(xì)胞提取補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物，蔗糖密度梯度超速離心法收集，并提純、鑒定。3.取培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞，加入不同濃度補(bǔ)體C5b-9

3、復(fù)合物，分別為0、1、10、20、40、80μg/ml，處理24h，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。并根據(jù)細(xì)胞膜有無溶破確定本研究后繼實(shí)驗(yàn)采用的補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物劑量。4.取正常RPE細(xì)胞和經(jīng)補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物作用后1h的RPE細(xì)胞，制作透射電子顯微鏡標(biāo)本，觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。5.將正常培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞按1×104/ml接種于特制的激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿。以鈣熒光指示劑Fluo-3/AM負(fù)載。于激光共聚焦顯微鏡下，選定負(fù)載良

4、好的RPE細(xì)胞視野，加入補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物，觀察細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度的變化?？偟挠^察時(shí)間15min，間隔時(shí)間15s。隨機(jī)選取視野內(nèi)20個(gè)不同細(xì)胞，對(duì)所選區(qū)域進(jìn)行熒光強(qiáng)度的定量分析，并記錄該區(qū)域熒光強(qiáng)度的全程變化情況。6.取培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞在補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物作用4h、24h后，分別提取各時(shí)間組及正常培養(yǎng)的細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后行PCR檢測VEGF、TGF-β2mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)

5、分析，對(duì)各組均數(shù)之間比較。 結(jié)果：1.體外培養(yǎng)的人原代RPE細(xì)胞，48h細(xì)胞貼壁，5-10d融合，傳代穩(wěn)定。細(xì)胞角蛋白抗體免疫組織化學(xué)染色陽性，符合上皮細(xì)胞特征。2.提取的補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物經(jīng)SDS-PAGE法鑒定，電泳呈現(xiàn)7條帶，從上至下依次為C5b、C5c、C6、C7、C8αγ、C9和C8β，與文獻(xiàn)相符。3.1、10、20μg/ml補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物作用24h，細(xì)胞形態(tài)無明顯改變。40μg/ml補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物作用2

6、4h，細(xì)胞邊界模糊，部分結(jié)構(gòu)消失，培養(yǎng)液內(nèi)可見大量黑色素顆粒。80μg/ml補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物作用24h，僅見極少量完整RPE細(xì)胞，培養(yǎng)液充滿黑色素顆粒。20μg/ml作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)選用劑量。4.透射電子顯微鏡下，正常培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞胞膜完整，在細(xì)胞的一面可見到大量的絨毛組織，胞漿內(nèi)存在大量的圓形或橢圓形色素顆粒，胞漿外未見雜質(zhì)結(jié)構(gòu)。20μg/ml補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物作用RPE細(xì)胞后，透射電子顯微鏡顯示色素顆粒從細(xì)胞內(nèi)釋出，細(xì)胞膜未

7、見明顯缺損，細(xì)胞周圍可見色素顆粒團(tuán)。5.培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞以10μmol/l的鈣熒光探針Fluo-3/AM，37℃孵育30min，可獲得最佳負(fù)載效果。在激光共聚焦顯微鏡下，20μg/ml補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物作用人RPE細(xì)胞后，多數(shù)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+熒光迅速增強(qiáng)，4min達(dá)到最大值，持續(xù)約6min后大部分細(xì)胞內(nèi)升高的Ca2+熒光開始下降，隨時(shí)間推移逐漸恢復(fù)至靜息水平。6.20μg/ml補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物作用人RPE細(xì)胞4、24h及正常對(duì)照

8、組，VEGFmRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為：1.53±0.49，1.32±0.39，1.00±0.15。與對(duì)照組比較，補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物作用后4h，VEGF表達(dá)明顯升高(p<0.01)；之后有下調(diào)趨勢，但24h與4h統(tǒng)計(jì)學(xué)無明顯差異(p>0.01)。TGF-β2mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為：0.72±0.13，0.46±0.22，0.24±0.076。與對(duì)照組比較，補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物作用后4hTGF-β2表達(dá)升高(p<0.01)；24h下

9、降(p<0.01)，但仍高于對(duì)照組(p<0.01)。 結(jié)論：1.本研究采用胰蛋白酶消化法成功培養(yǎng)了人原代RPE細(xì)胞，細(xì)胞傳代穩(wěn)定，可滿足實(shí)驗(yàn)研究需求。2.本研究通過實(shí)驗(yàn)室提取補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物作用人RPE細(xì)胞，首次證實(shí)補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物可改變RPE細(xì)胞膜的通透性，效果與補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物的作用劑量相關(guān)。大劑量補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物直接導(dǎo)致RPE細(xì)胞膜破碎，細(xì)胞壞死，降低作用劑量，則僅有色素顆粒通過RPE細(xì)胞膜釋出。3.本研究