補體C5b-9復合物對人RPE細胞膜通透性及VEGF、TGF-β2表達的影響.pdf

1、目的：補體系統激活，發(fā)生級聯反應，是人體抵御外來侵害的第一線，但如果反應過度，則損傷正常組織而致病，其在老年性黃斑變性(AMD)的脈絡膜新生血管(CNV)發(fā)病中的作用越來越受關注。補體C5b-9復合物，是補體級聯反應的終末產物，在AMD患者CNV區(qū)域的視網膜色素上皮(RPE)細胞表面可檢測到其存在。本研究通過觀察補體C5b-9復合物與人RPE細胞膜結合后細胞的形態(tài)學改變、胞漿內鈣離子濃度變化及血管內皮生長因子(VEGF)、轉化生長因子(

2、TGF)-β2mRNA水平變化，探討補體C5b-9復合物對人RPE細胞膜通透性及細胞分子生物學行為的影響，探討補體C5b-9復合物在CNV發(fā)病中的作用。 方法：1.采用胰蛋白酶消化法培養(yǎng)人原代RPE細胞，并使用細胞角蛋白抗體免疫組織化學染色鑒定。細胞傳代至第2代一第3代用于后繼實驗。2.采用大鼠血清接觸兔紅細胞提取補體C5b-9復合物，蔗糖密度梯度超速離心法收集，并提純、鑒定。3.取培養(yǎng)的人RPE細胞，加入不同濃度補體C5b-9

3、復合物，分別為0、1、10、20、40、80μg/ml，處理24h，光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變。并根據細胞膜有無溶破確定本研究后繼實驗采用的補體C5b-9復合物劑量。4.取正常RPE細胞和經補體C5b-9復合物作用后1h的RPE細胞，制作透射電子顯微鏡標本，觀察細胞超微結構的改變。5.將正常培養(yǎng)的人RPE細胞按1×104/ml接種于特制的激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿。以鈣熒光指示劑Fluo-3/AM負載。于激光共聚焦顯微鏡下，選定負載良

4、好的RPE細胞視野，加入補體C5b-9復合物，觀察細胞內鈣熒光強度的變化?？偟挠^察時間15min，間隔時間15s。隨機選取視野內20個不同細胞，對所選區(qū)域進行熒光強度的定量分析，并記錄該區(qū)域熒光強度的全程變化情況。6.取培養(yǎng)的人RPE細胞在補體C5b-9復合物作用4h、24h后，分別提取各時間組及正常培養(yǎng)的細胞總RNA，逆轉錄后行PCR檢測VEGF、TGF-β2mRNA的相對表達量。結果采用SPSS13.0統計軟件，方差分析法進行統計學

5、分析，對各組均數之間比較。 結果：1.體外培養(yǎng)的人原代RPE細胞，48h細胞貼壁，5-10d融合，傳代穩(wěn)定。細胞角蛋白抗體免疫組織化學染色陽性，符合上皮細胞特征。2.提取的補體C5b-9復合物經SDS-PAGE法鑒定，電泳呈現7條帶，從上至下依次為C5b、C5c、C6、C7、C8αγ、C9和C8β，與文獻相符。3.1、10、20μg/ml補體C5b-9復合物作用24h，細胞形態(tài)無明顯改變。40μg/ml補體C5b-9復合物作用2

6、4h，細胞邊界模糊，部分結構消失，培養(yǎng)液內可見大量黑色素顆粒。80μg/ml補體C5b-9復合物作用24h，僅見極少量完整RPE細胞，培養(yǎng)液充滿黑色素顆粒。20μg/ml作為進一步實驗選用劑量。4.透射電子顯微鏡下，正常培養(yǎng)的人RPE細胞胞膜完整，在細胞的一面可見到大量的絨毛組織，胞漿內存在大量的圓形或橢圓形色素顆粒，胞漿外未見雜質結構。20μg/ml補體C5b-9復合物作用RPE細胞后，透射電子顯微鏡顯示色素顆粒從細胞內釋出，細胞膜未

7、見明顯缺損，細胞周圍可見色素顆粒團。5.培養(yǎng)的人RPE細胞以10μmol/l的鈣熒光探針Fluo-3/AM，37℃孵育30min，可獲得最佳負載效果。在激光共聚焦顯微鏡下，20μg/ml補體C5b-9復合物作用人RPE細胞后，多數細胞內的Ca2+熒光迅速增強，4min達到最大值，持續(xù)約6min后大部分細胞內升高的Ca2+熒光開始下降，隨時間推移逐漸恢復至靜息水平。6.20μg/ml補體C5b-9復合物作用人RPE細胞4、24h及正常對照

8、組，VEGFmRNA的相對表達量分別為：1.53±0.49，1.32±0.39，1.00±0.15。與對照組比較，補體C5b-9復合物作用后4h，VEGF表達明顯升高(p<0.01)；之后有下調趨勢，但24h與4h統計學無明顯差異(p>0.01)。TGF-β2mRNA的相對表達量分別為：0.72±0.13，0.46±0.22，0.24±0.076。與對照組比較，補體C5b-9復合物作用后4hTGF-β2表達升高(p<0.01)；24h下

9、降(p<0.01)，但仍高于對照組(p<0.01)。 結論：1.本研究采用胰蛋白酶消化法成功培養(yǎng)了人原代RPE細胞，細胞傳代穩(wěn)定，可滿足實驗研究需求。2.本研究通過實驗室提取補體C5b-9復合物作用人RPE細胞，首次證實補體C5b-9復合物可改變RPE細胞膜的通透性，效果與補體C5b-9復合物的作用劑量相關。大劑量補體C5b-9復合物直接導致RPE細胞膜破碎，細胞壞死，降低作用劑量，則僅有色素顆粒通過RPE細胞膜釋出。3.本研究