JWA參與PKC激活c-Raf-MEK-ERK信號通路的分子機(jī)制.pdf

1、本課題著重探討在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中JWA基因表達(dá)的規(guī)律和特點(diǎn)，特別是與蛋白激酶C(PKC)激活的MAPK信號通路的關(guān)系。旨在初步揭示JWA基因參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡信號通路的分子機(jī)制，從而為闡明腫瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制(特別是與環(huán)境因素相關(guān)的)，進(jìn)而對腫瘤的化學(xué)預(yù)防提供新的科學(xué)依據(jù)。 一、JWA作為PKC下游分子參與調(diào)節(jié)TPA誘導(dǎo)的K562細(xì)胞分化TPA是公認(rèn)的PKC激動劑。已知TPA誘導(dǎo)K562分化涉及多個(gè)信號轉(zhuǎn)

2、導(dǎo)通路，但確切的分子機(jī)制還未被闡明。為進(jìn)一步研究和探討JWA參與TPA誘導(dǎo)的K562細(xì)胞分化的分子機(jī)制，我們成功建立了TPA誘導(dǎo)K562細(xì)胞向單核-巨噬細(xì)胞樣分化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以及TPA誘導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過表達(dá)JWA(JWA-K562)和低表達(dá)JWA(asJWA-K562)的K562細(xì)胞模型。研究結(jié)果顯示，隨著TPA誘導(dǎo)的K562細(xì)胞單核-巨噬細(xì)胞樣分化，JWA蛋白表達(dá)明顯增加。100ng/mlTPA可顯著抑制未轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞的增殖(第3、5

3、天)，并誘導(dǎo)分化。與之比較，TPA處理的asJWA-K562細(xì)胞的增殖未受明顯抑制，然而TPA處理JWA-K562細(xì)胞的增殖同樣受到明顯抑制。采用PKC抑制劑H-7(終濃度20μmol/L)預(yù)處理K562細(xì)胞24h后，再用200ng/mlTPA誘導(dǎo)K562細(xì)胞48h。Westernblot結(jié)果顯示，JWA蛋白表達(dá)受到明顯抑制。此外，將10μmol/LJWA反義寡核苷酸(antisenseJWAoligonucleotides，ajos)

4、、20μmol/LH-7與K562細(xì)胞分別或共同孵育24h，以阻斷JWA表達(dá)PKPKC表達(dá)，再以200ng/mlTPA處理48h。流式細(xì)胞儀對細(xì)胞表面抗原分析顯示，下調(diào)JWA蛋白表達(dá)水平能部分抑制TPA誘導(dǎo)的K562細(xì)胞分化；當(dāng)同時(shí)用ajos和H-7處理時(shí)，則TPA誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化的能力基本被完全阻斷(細(xì)胞表面抗原CD¨b的表達(dá)下降65﹪，CD33上升34﹪)，對TPA誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化的抑制作用呈現(xiàn)相加的效應(yīng)。進(jìn)一步證實(shí)JWA蛋

5、白的表達(dá)為TPA誘導(dǎo)K562細(xì)胞向單核-巨噬細(xì)胞樣分化所必須；TPA誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化不僅依賴PKC，而且也依賴JWA的表達(dá)；TPA對JWA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用既有直接作用，也可通過PKC的介導(dǎo)。 二、JWA通過PKC-α介導(dǎo)參與TPA誘導(dǎo)的細(xì)胞分化PKC家族成員多，分布廣。各亞型有著不同的酶學(xué)特性，在細(xì)胞信號傳遞中的作用也有著顯著差異。PKC-α就是其中最重要，最典型的PKC亞型和信號分子之一。為進(jìn)一步探討TPA是如何通過PKC調(diào)

6、節(jié)JWA基因的，是否也同樣通過PKC-α激活JWA基因。我們瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PKC-α反義寡核苷酸(antisense-PKC-α)，分別導(dǎo)入K562和HeLa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染細(xì)胞12h后，再分別用TPA(50ng/ml)和ATRA(1μmol/L)處理48h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TPA不再刺激JWA蛋白表達(dá)的增加。這表明TPA可通過激活PKC-α調(diào)節(jié)JWA基因。推測PKC-α直接磷酸化了JWA編碼蛋白中的絲氨酸殘基(Ser)，從而激活JWA參與細(xì)胞分化的

7、調(diào)控。但是PKC-α究竟是如何磷酸化JWA的磷酸化位點(diǎn)的，還有待于進(jìn)一步研究。此外，鑒于ATRA處理瞬時(shí)轉(zhuǎn)染antisense-PKC-α的HeLa細(xì)胞，JWA蛋白表達(dá)沒有明顯變化，表明ATRA誘導(dǎo)JWA蛋白表達(dá)增加是通過其它的信號分子。 三、JWA參與調(diào)節(jié)ATRA抑制HeLa細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡眾所周知，ATRA可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡。JWA基因是受ATRA誘導(dǎo)的新的細(xì)胞骨架樣基因，與細(xì)胞的分化和凋亡相關(guān)。

8、因此，為進(jìn)一步深入研究JWA基因參與ATRA抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化和凋亡的可能的分子機(jī)制，我們成功構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達(dá)JWA和低表達(dá)JWA的HeLa細(xì)胞株，并在此基礎(chǔ)上建立了ATRA處理上述HeLa細(xì)胞模型。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以不同濃度的ATRA(0.05、0.1、0.5、1.0、5、10μmol/L)處理HeLa細(xì)胞不同時(shí)間(1、3、6、12、24和48h)，JWA蛋白表達(dá)均上調(diào)，并存在著時(shí)間-反應(yīng)和劑量-反應(yīng)關(guān)系；ATRA同時(shí)

9、也增強(qiáng)JWA的啟動子轉(zhuǎn)錄活性。MTT、Hoechst和流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：ATRA引起的細(xì)胞增殖抑制和促凋亡現(xiàn)象與JWA蛋白表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)。提示JWA對于ATRA引起的細(xì)胞增殖抑制和促凋亡進(jìn)程可能是至關(guān)重要的。 為進(jìn)一步探討ATRA如何刺激JWA表達(dá)的。我們構(gòu)建了JWA部分啟動子(-1680bp/+107bp)的不同長短片斷的報(bào)告基因。采用CAT-ELISA檢測ATRA處理HeLa細(xì)胞對JWA基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)

10、，ATRA(5μmol/L)處理48h，JWA基因-194bp/+107bp啟動子片斷相對CAT酶活性顯著增加，與對照比較增加約7倍，并且也顯著高于ATRA處理的其它JWA啟動子DNA片斷CAT酶活性(p＜0.001)。進(jìn)一步用Southwestern實(shí)驗(yàn)檢測到了未經(jīng)ATRA處理組JWA基因序列-194bp/-68bp片斷DNA探針與某種核蛋白(分子量約為33.5kDa)存在的特異結(jié)合；在ATRA(5μmol/L，48h)處理后卻消失了

11、。提示在JWA基因啟動子序列-194bp/-68bpDNA片斷中可能存在某順式作用元件(cis-actingelement)。ATRA可能通過去除與JWA啟動子結(jié)合的阻遏因子而調(diào)節(jié)JWA基因的表達(dá)，從而進(jìn)一步激活受JWA調(diào)節(jié)的下游信號分子的作用，最終調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的分化或凋亡。 由于JWA基因啟動子-194bp/+107bp序列中存在兩個(gè)CCAAT順式作用元件，而-194bp/-68bpDNA片斷只包含其中近5’端的第一個(gè)CCAAT

12、順式結(jié)合元件，都是CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBPs)的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)C/EBPs的亞型C/EBPε的分子量也約為33.5kDa。因此，可以認(rèn)為存在于細(xì)胞內(nèi)的該阻遏蛋白在基礎(chǔ)狀態(tài)下，幾乎只與JWA啟動子中近5’端第一個(gè)CCAAT結(jié)合。我們推測該未知核蛋白可能是C/EBPs的一個(gè)亞型，可以與JWA啟動子-194/+107bp片斷中近5’端的第一個(gè)CCAAT特異性結(jié)合或解離。ATRA可能是通過激活C/EBPs與JWA基因啟動子中近5’

13、端的第一個(gè)CCAAT特異性解離DNA結(jié)合蛋白，調(diào)控JWA轉(zhuǎn)錄活性，從而介導(dǎo)JWA參與調(diào)控ATRA引起的細(xì)胞增殖抑制和促凋亡進(jìn)程。但是直接的證據(jù)還有待于進(jìn)一步證實(shí)。 四、JWA調(diào)節(jié)ERK的磷酸化激活c-Raf-MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是諸多信號途徑中與細(xì)胞增殖、分化密切相關(guān)的最重要的信號通路之一。目前研究較多的是ERK1/2。ERK1/2蛋白水平的活化是TPA和ATRA作用細(xì)胞后的必然事件，涉及細(xì)胞增殖抑制、分化和凋亡。為了探討

14、JWA基因參與調(diào)控TPA誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化是否涉及ERK，我們采用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ajos(10μmol/L)，導(dǎo)入K562細(xì)胞。轉(zhuǎn)染12h后，用TPA(100ng/m1)分別處理0.5、1、24h。Westernblot結(jié)果顯示，ERK1/2總蛋白水平在藥物作用后無明顯變化。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ajos明顯下調(diào)TPA誘導(dǎo)的JWA蛋白的表達(dá)水平；同時(shí)，磷酸化ERK1/2蛋白(p-ERK1/2)表達(dá)水平也明顯下降。這表明下調(diào)JWA表達(dá)可抑制ERK的

15、磷酸化修飾。 為了進(jìn)一步證實(shí)JWA對ERK的磷酸化的調(diào)節(jié)作用。我們構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達(dá)JWA的細(xì)胞株(JWA-HeLa)和低表達(dá)JWA的細(xì)胞株(asJWA-HeLa)，并以不同濃度的TPA(5、10、20、50ng/ml)和以不同濃度的ATRA(0.05、0.1、0.5、1、5、10μmol/L)分別處理上述細(xì)胞48h。結(jié)果同樣顯示，下調(diào)JWA表達(dá)可抑制ATRA誘導(dǎo)的ERK磷酸化。另一方面，采用MEK抑制劑PD98059抑制了E

16、RK磷酸化，但并不影響JWA蛋白表達(dá)水平。 因此，我們推測JWA參與TPA誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化，以及ATRA抑制HeLa細(xì)胞細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡過程，均通過影響ERK的磷酸化而最終實(shí)現(xiàn)的。JWA蛋白表達(dá)對MAPK級聯(lián)反應(yīng)中ERK的磷酸化激活是至關(guān)重要的。ATRA誘導(dǎo)ERK磷酸化可能依賴于JWA的表達(dá)，JWA可能是ATRA激活的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中新的信號調(diào)節(jié)分子。 五、JWA通過調(diào)節(jié)ERK磷酸化影響冷休克誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞

17、凋亡ERK介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)十分廣泛，作為細(xì)胞應(yīng)答環(huán)境刺激的主要信號分子之一，同樣涉及細(xì)胞的多種理化應(yīng)激的刺激。而JWA本身是活躍的環(huán)境應(yīng)答基因，似乎作為ERK的上游分子對其有調(diào)節(jié)作用。與熱休克反應(yīng)相比，有關(guān)生物體對低溫適應(yīng)的研究，還不是特別深入。文獻(xiàn)報(bào)道冷休克誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡涉及ERK信號通路。為此，我們設(shè)計(jì)用冷休克細(xì)胞模型探討JWA是否對ERK分子及其相應(yīng)的作用有調(diào)控作用。 我們建立了HeLa細(xì)胞冷休克處理模型：分別將HeLa、a

18、sJWA-HeLa置于4℃冷休克處理0.5-4h，然后恢復(fù)37℃18h；同樣，PD98059預(yù)處理24h后，再使HeLa細(xì)胞冷休克。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著冷休克導(dǎo)致HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡，JWA蛋白表達(dá)顯著增加；與對照組比較，抑制JWA蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制ERK磷酸化，細(xì)胞凋亡率均顯著增加(P＜0.05，P＜0.01)。提示JWA和ERK參與冷休克誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號通路。結(jié)合前面的研究，我們認(rèn)為JWA參與冷休克誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能同樣是通過調(diào)節(jié)