Raf-Erk1-2-Merk信號傳導通路在脊髓損傷修復中的病理機制研究.pdf

1、目的：研究發(fā)現(xiàn)Raf/Erk1/2/Merk信號傳導通路控制著很多細胞的反應，對體內(nèi)外的細胞的凋亡有很重要的作用。為研究Raf/Erk1/2/Merk信號傳導通路在脊髓損傷后的病理機制，①通過培養(yǎng)脊髓運動神經(jīng)細胞和脊髓星形膠質(zhì)細胞，構建脊髓損傷的體外細胞模型，對該信號通路的機制進行探索。②建立脊髓損傷的動物模型，應用Raf/Erk1/2/Merk信號通路抑制劑，觀察小鼠脊髓損傷后功能恢復和軸突再生，探討Raf/Erk1/2/Merk信號

2、通路對動物模型脊髓損傷后神經(jīng)再生的作用機制。
　　 方法：從新生1天的C57BL/6J胎鼠脊髓內(nèi)分離培養(yǎng)脊髓運動神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，利用腺病毒攜帶綠色熒光蛋白(Ad-GFP)和腺病毒攜帶Raf-1蛋白(Ad-Raf1)感染脊髓運動神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，觀察細胞粘附和遷移能力的變化，通過免疫組化、Western-blot、RT-PCR和細胞電生理技術(patch-clamp)觀察Raf/Erk1/2/Merk信號通路上調(diào)后對脊髓

3、運動神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的發(fā)育的影響。并將基因轉染后的脊髓運動神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)，觀察Raf/Erk1/2/Merk信號通路上調(diào)后兩種細胞之間的相互作用。利用NYU Impactor-Ⅱ打擊器制作成年C57BL/6J小鼠胸10(T10)脊髓損傷模型（打擊重量和高度為:10g×5mm）。利用Raf/Erk1/2/Merk信號通路抑制劑U0126，觀察Raf/Erk1/2/Merk信號通路抑制后對脊髓損傷神經(jīng)修復的作用，將60只大鼠

4、隨機分成3組:A組:非手術組（注射DMSO）;B組:脊髓損傷組(注射DMSO);C組:脊髓損傷組（注射U0126組）。術后采用BMS評分和Rotard試驗對動物后肢功能恢復情況進行評價。利用免疫組化、BDA、Western-blot和膜片鉗技術(Patch-clamp)觀察動物損傷后的神經(jīng)再生變化。綜合以上數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計學分析。
　　 結果：①成功分離和純化了脊髓運動神經(jīng)元和脊髓星形膠質(zhì)細胞，并上調(diào)了細胞內(nèi)Raf/Erk1/2/

5、Merk的信號水平。升高的Raf/Erk1/2/Merk信號水平促進了脊髓運動神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞的遷移能力，但是阻礙了脊髓運動神經(jīng)細胞的突觸形成，抑制了脊髓運動神經(jīng)細胞的樹突向成熟分化的能力。但是隨著Raf/ERK/Merk信號水平的升高，本研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞在體外發(fā)育明顯增強，促進了星形膠質(zhì)細胞的發(fā)育和成熟。與星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)72h后，脊髓運動神經(jīng)元突觸標志物增加并出現(xiàn)成簇現(xiàn)象，軸突和樹突也進一步分化，突觸的數(shù)目較對照組增加了7倍

6、(p＜0.001)。②在動物體模型內(nèi)，U0126組動物神經(jīng)功能恢復明顯好于對照組，兩組間有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。免疫組化及BDA染色結果顯示U0126組有較多的再生神經(jīng)纖維通過損傷區(qū)，而脊髓損傷組和非手術組幾乎未見再生神經(jīng)纖維穿越。免疫組化染色顯示U0126組損傷空洞明顯小于其余兩組(p＜0.05)。電生理學檢測結果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，U0126組潛伏期延長(p＜0.05)，動作電位幅度增高(p＜0.05)，長時程動作電位明顯增加(

7、P＜0.01)。
　　 結論：Raf/Erk1/2/Merk信號傳導水平的升高會損傷脊髓神經(jīng)細胞的發(fā)育并造成神經(jīng)信號傳導的不平衡，相反，信號水平的升高會刺激膠質(zhì)細胞增生并分泌多種神經(jīng)誘導因子，促進共培養(yǎng)早期脊髓神經(jīng)細胞的成熟，從而為臨床治療脊髓損傷黃金治療時間點的選擇提供了理論依據(jù)。抑制該信號傳導通路可以促進脊髓損傷動物的功能恢復、軸突再生以及電生理學改善，以上結果證明了Raf/Erk1/2/Merk信號通路在脊髓損傷的修復過程