Ras-Raf-Erk1-2信號通路過度表達與自閉癥的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 自閉癥也稱孤獨癥，是較嚴重的全面性精神發(fā)育障礙性疾病，和遺傳有一定關(guān)系，但是致病基因尚未被查出，因此臨床診斷困難，而且無法治愈。自閉癥的診斷標準主要包括其核心行為癥狀:(1)社會關(guān)系障礙;(2)語言溝通障礙;(3)興趣狹窄和刻板重復(fù)動作[1]。男女患病率比例為4:1[2]。亞洲、歐洲和北美地區(qū)確診患病率約0.6％-1％[3，4，5，6]。我國尚無全國大規(guī)模的的流行病學(xué)調(diào)查，估計嬰幼兒發(fā)病率約0.4％左右[

2、7，8]。在過去20年內(nèi)，歐洲、美國的自閉癥發(fā)病率上升5-10倍[9，10]。一些藥物用于治療自閉癥，但效果欠佳[11]，主要依靠行為治療改善患者的社交及語言交流能力[12]。英國每年用于治療自閉癥兒童的費用達2.7億英鎊[13]，美國每個自閉癥兒童早期醫(yī)療服務(wù)的每年開支是35，000美元[14]，對社會及家庭造成沉重的精神及經(jīng)濟負擔，使自閉癥成為重要的公共健康問題。
　　 自閉癥病因尚不清楚，過去曾經(jīng)認為，其病因可能與社會心理

3、因素有關(guān)，但目前普遍認為是多因素導(dǎo)致，主要包括遺傳、環(huán)境因素[15,16,17,18]。10％到20％自閉癥患者存在染色體異常情況，目前已知的相關(guān)染色體有7q、22q13、2q37、18q、Xp[19]。細胞遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)常見的自閉癥易感基因包括:NLGNS(NLGN1，NLGN3,andNLGN4X),MECP2、FMR1、TSC1/2、SHANK3、CNTNAP2等[20,21,22,23]，提示孤獨癥是一種多基因遺傳病。
　

4、　 有學(xué)者猜測具有攜帶自閉癥易感基因背景者，暴露于危險環(huán)境因子[24,25]，發(fā)病率明顯升高[26]。主要致病因子包括:汞，鎘，鎳，三氯乙烯，氯乙烯[27]，尤其在妊娠期或圍產(chǎn)期暴露[28]。研究發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育早期，即受精后20至40天的器官形成期為自閉癥發(fā)病的易感期。如果在此期間胚胎受藥物、重金屬或母體不良狀況等宮內(nèi)環(huán)境因素的影響，胚胎未來發(fā)生自閉癥的風險顯著升高。產(chǎn)前暴露于“丙戊酸”、“乙醇”、“沙利度胺”和“米索前列醇”，可導(dǎo)致子

5、代患自閉癥的機率增加[29]。早于1943年LeoKanner首次發(fā)現(xiàn)11名1歲的兒童表現(xiàn)出“情感接觸中孤獨性障礙”時，就推測自閉癥可能來源于產(chǎn)前[30]。最新研究表明當嬰兒出生時體重低于正常嬰兒體重時，其患上自閉癥的幾率比正常體重的嬰兒高出5倍[31]。在先天異常與環(huán)境因素相互作用下，自閉癥患者的臨床癥狀加重，或許由于遺傳脆弱性，神經(jīng)系統(tǒng)更容易達到自閉癥的發(fā)病“門檻”[32]。
　　 最近有研究發(fā)現(xiàn)16號染色體缺失與自閉癥相關(guān)

6、，而編碼ERK1蛋白的MAPK3基因位于16號染色體[33]。Erk2所在的22q11.2缺失也與自閉癥發(fā)病相關(guān)[105，106]。MAPK基因位于22q1.3DGS區(qū)，許多患者的這個區(qū)域缺失，導(dǎo)致一系列的心臟、皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)異常[105-108]，臨床病例研究發(fā)現(xiàn)部分自閉癥患者存在22q11.2缺失和重復(fù)，提示22q11.2可能與自閉癥相關(guān)研究結(jié)果表明，MAPK級聯(lián)不同元素的的單倍劑量不足可以導(dǎo)致類似的解剖異常和智力障礙。越來越多研究

7、表明自閉癥可能與神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)。Ras/Raf/Erk1/2信號通路促進神經(jīng)細胞凋亡。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)自閉癥患者及自閉癥模型小鼠BTBRT+tf/J(BTBR)的大腦皮質(zhì)中Ras/Raf/Erk1/2信號通路蛋白表達異常升高[34，35]，Mek抑制劑U0126可抑制BTBR小鼠大腦皮質(zhì)細胞Ras/Raf/Erk1/2信號通路過度上調(diào)，部分糾正BTBR小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞各種異常行為，進一步驗證Ras/Raf/Erk1/2信號通路可

8、能參與自閉癥的發(fā)病過程。
　　 BTBR是一種近交系小鼠，具有自閉癥的三大核心癥狀:社交減少、社交場合中話語少、重度的重反復(fù)理毛行為[36-38]。BTBR小鼠也是唯一一種具備所有自閉癥的行為的品系。最近研究發(fā)現(xiàn)BTBR小鼠DISC1基因上有25對堿基對缺失，而DISC1證實是精神障礙疾病的易感基因，包括精神分裂癥、自閉癥[39]。因此，BTBR小鼠是目前研究自閉癥的理想模型。
　　 U0126（1,4-二氨基-2，3-

9、氰基-1,4-雙[2-氨基苯基硫代]丁二烯）是有絲分裂原激活蛋白激酶激酶1/2(Mek1/2)抑制劑，能抑制細胞遷移、侵襲、黏附、轉(zhuǎn)移、mRNA表達及蛋白激活，例如MMP-1，MMP-2，MMP-9和MT1-MMP[40]。已被用于在體內(nèi)和體外研究[41]。
　　 我們前期試驗發(fā)現(xiàn)2周大小的BTBR小鼠大腦皮質(zhì)Ras/Raf/Erk1/2信號通路異常上調(diào)，但Ras/Raf/Erk1/2信號通路異常上調(diào)與時間關(guān)系尚不清楚。本實驗以

10、BTBR小鼠為自閉癥模型，應(yīng)用WesternBlot檢測不同年齡的BTBR小鼠大腦中Ras/Raf/Erk1/2信號通路的表達情況，探討自閉癥Ras/Raf/Erk1/2的異常表達情況及起始時間點。
　　 根據(jù)Ras/Raf/Erk1/2信號通路異常表達的開始時間，應(yīng)用Mek抑制劑降低BTBR小鼠中Erk及Mek的磷酸化水平，然后進行行為學(xué)測試，探討Ras/Raf/Erk1/2信號通路與自閉癥的異常行為的影響作用，免疫熒光檢測小

11、鼠大腦皮質(zhì)區(qū)、海馬CA1及CA3區(qū)中VGLUT1/VGAT比值、Map2和PSD-95的表達情況，DiI染色檢測神經(jīng)元成熟樹突棘的形成情況，進一步探討Ras/Raf/Erk1/2信號通路與自閉癥的發(fā)病關(guān)系。
　　 方法:
　　 1、WesternBlot檢測不同年齡的BTBR小鼠大腦中Ras/Raf/Erk1/2信號通路的表達情況
　　 分別解剖新生、3周、6周大小的BTBRT+tfJ小鼠及其相對應(yīng)年齡的C57B

12、L/6(B6)小鼠的大腦組織，進行蛋白勻漿，應(yīng)用WesternBlot檢測每個年齡段大腦組織中Ras/Raf/Erk1/2信號通路中各成員的磷酸化蛋白表達情況(包括P-A-Raf、P-B-Raf、P-C-Raf、P-Erk1/2、P-Mek1/2)。
　　 2、Mek1/2抑制劑U0126治療BTBR小鼠
　　 應(yīng)用Mek1/2抑制劑U0126治療BTBR小鼠，從出生3天開始，400μg/kg，腹腔注射，每天1次，連續(xù)3

13、周。對照組包括相應(yīng)年齡的BTBR小鼠及B6小鼠，予以相應(yīng)劑量的40％DMSO腹腔注射，每天1次，連續(xù)3周。應(yīng)用WesternBlot檢測Mek1/2抑制劑對P-Mek1/2及P-Erk1/2的抑制情況，初步評價治療效果。
　　 3、行為學(xué)實驗檢測Mek1/2抑制劑治療后對BTBR小鼠異常行為的影響情況
　　 根據(jù)實驗對動物造成壓力從輕到重的順序，應(yīng)用社交活動實驗、高架十字迷宮實驗、明暗穿箱實驗、曠場實驗、埋珠實驗、恐懼制

14、約實驗分別檢測Mek1/2抑制劑治療后對BTBR小鼠社交行為、焦慮情況、自發(fā)活動、重復(fù)與刻板動作、記憶能力的影響。實驗安排見表1:
　　 兩個實驗間需間隔2-3天。
　　 4、免疫熒光檢測Mek1/2抑制劑對BTBR小鼠神經(jīng)系統(tǒng)VGLUT1/VGAT比值、Map2和PSD-95表達情況的影響
　　 BTBR小鼠及B6小鼠接受U0126DMSO治療3周后，取其大腦組織固定后冰凍切片，免疫熒光技術(shù)檢測小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)、

15、海馬CA1及CA3區(qū)中VGLUT1、VGAT、Map2和PSD-95的表達情況，拍攝條件一致下應(yīng)用Z-stack疊加拍片，ImageJ圖像軟件分析熒光強度，每組6個切片，每個功能區(qū)域隨機數(shù)10個細胞，共計數(shù)60個神經(jīng)細胞。
　　 5、DiI染色檢測Mek1/2抑制劑對BTBR小鼠神經(jīng)元成熟樹突棘的形成的影響
　　 BTBR小鼠及B6小鼠接受U0126DMSO治療3周后，取其大腦組織固定后振蕩切片，Vybrant-DiIc

16、ell-labeling孵育36小時后浸洗、封片。一周內(nèi)應(yīng)用共聚焦顯微鏡Z-stack疊加拍片;每組3只小鼠，每只小鼠計數(shù)3-4個神經(jīng)元，每組共計算9-12個樹突棘。
　　 6、統(tǒng)計方法
　　 應(yīng)用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，兩組間的蛋白表達水平比較應(yīng)用兩樣本t檢驗。三組間的蛋白表達水平比較應(yīng)用方差分析。社交活動實驗中三組小鼠三個房間的停留時間、進入次數(shù)、嗅的時間比較應(yīng)用重復(fù)測量的方差分析，自梳理及靜止時間應(yīng)用方差

17、分析;高架十字迷宮中三組間開臂時間應(yīng)用方差分析;明暗穿箱實驗中三組間明箱停留時間、進入次數(shù)應(yīng)用方差分析;曠場實驗中自梳理時間、面壁站立時間及非活動時間應(yīng)用方差分析;埋珠實驗中被掩埋珠子的數(shù)量應(yīng)用方差分析;恐懼制約實驗中三組間的凝滯時間應(yīng)用方差分析;三組間免疫熒光強度、成熟突觸數(shù)目比較采用方差分析。先進行方差齊性檢驗，方差不齊時用Welch校正;組間多重比較，方差齊性時采用LSD法，方差不齊時采用DunnettT3法。所有數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±

18、標準誤，P值＜0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果:
　　 1、BTBR小鼠大腦組織Ras/Raf/Erk1/2信號通路的異常表達時間
　　 與B6小鼠相比，BTBR小鼠大腦組織中P-B-Raf、P-C-Raf、P-Mek1/2、P-Erk1/2的條帶更強，其平均表達量均升高(P-B-Raf:t=7.192，P＜0.001;P-C-Raf:t=2.661，P=0.024;P-Mek1/2:t=8.912,P＜0.0

19、01;P-Erk1/2:t=3.733,P=0.004)，其中P-Mek1/2升高最明顯，達5.318倍。3周齡大小BTBR小鼠及B6小鼠腦組織中P-B-Raf、P-C-Raf、P-Mek1/2、P-Erk1/2蛋白表達水平未見統(tǒng)計學(xué)差異(P-B-Raf:t=1.663,P=0.127;P-C-Raf:t=1.019,P=0.332;P-Mek1/2:t=2.188,P=0.053;P-Erk1/2:t=1.341，P=0.210)。與

20、B6小鼠相比，6周齡大小BTBR小鼠各蛋白的表達量未見異常升高(P-B-Raf:t=2.127，P=0.059;P-C-Raf:t=0.394，P=0.702;P-Mek1/2:t=0.961,P=0.359;P-Erk1/2:t=0.916,P=0.381)。
　　 2、Mek1/2抑制劑對P-Erk1/2蛋白的抑制作用
　　 應(yīng)用Mek1/2抑制劑U0126連續(xù)治療3周后，WesternBlot檢測BTBRU0126

21、、BTBRDMSO、B6DMSO三組間腦組織的P-Erk1/2表達水平發(fā)現(xiàn)三組間有顯著性差異(F=6.398，P=0.010)。BTBRU0126組的P-Erk1/2蛋白條帶較BTBRDMSO組弱，相對表達量下降約47％(F=3.175,P=0.010)。而B6DMSO組的相對表達量與BTBRDMSO組間沒有顯著性差異(F=1.342,P=0.209)。
　　 3、Mek1/2抑制劑(U0126)對BTBR小鼠行為的影響

22、　　 3.1.Mek1/2抑制劑(U0126)對BTBR小鼠社交行為的影響
　　 社交行為測試學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，社交(Sociability)階段三組停留在陌生小鼠房間(strangerchamber)的時間比空鐵杯房間(novelobjectchamber)更多(F=18.124，P=0.001)。B6DMSO組停留在陌生小鼠房間(strangerchamber)的時間與空鐵杯房間有統(tǒng)計學(xué)差異(F=8.383,P=0.015)，但

23、是BTBRU0126組、BTBRDMSO組在陌生小鼠房間的時間與空鐵杯房間時間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(F=2.513，P=0.141;F=1.635，P=0.227)。三組在陌生小鼠房間嗅的時間與空鐵杯房間的時間有統(tǒng)計學(xué)差異(F=15.201,P=0.000)，B6DMSO組、BTBRU0126在陌生小鼠房間嗅的時間與空鐵杯房間的時間有統(tǒng)計學(xué)差異(F=9.598，P=0.010;F=6.783，P=0.024)，而BTBRDMSO組沒有統(tǒng)計學(xué)差

24、異(F=1.693，P=0.220)。
　　 3.2.Mek1/2抑制劑(U0126)對BTBR小鼠焦慮情緒的影響
　　 高架十字迷宮試驗測試結(jié)果顯示三組間的開臂停留時間有統(tǒng)計學(xué)差異(F=3.607,P=0.038)，但是BTBRU0126組與BTBRDMSO組沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.159)。明暗穿箱實驗試驗結(jié)果顯示三組間的明箱(lightbox)停留時間百分比有統(tǒng)計學(xué)差異(F=26.219,P=0.000)，但是BT

25、BRU0126和BTBRDMSO組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（F=0.902,P=0.377）。三組間的明箱進入次數(shù)有統(tǒng)計學(xué)差異(F=7.658,P=0.026)，B6組和BTBRDMSO組有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.009)，但B6組和BTBRU0126組、BTBRU0126和BTBRDMSO組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.0.056;P=0.435)。
　　 3.3.Mek1/2抑制劑(U0126)對BTBR小鼠重復(fù)刻板動作的影響
　　

26、 應(yīng)用埋珠實驗檢測小鼠的重復(fù)刻板動作情況，計算每組掩埋1/2以上的大理石個數(shù)，發(fā)現(xiàn)三組間掩埋的大理石球沒有統(tǒng)計學(xué)差異(F=2.940，P=0.067)。社交行為測試學(xué)習(xí)慣階段及社交階段三組間的自梳理時間均有顯著性差異(F=15.526，P=0.000;F=0.888，P=0.000），但BTBRU0126組、BTBRDMSO組沒有顯著性差異(P=0.219;P=0.596)。曠場實驗三組間的自梳理時間(Groomingtime)有統(tǒng)計學(xué)

27、意義(F=9.649，P=0.001)，但是BTBRU0126組與BTBRDMSO組沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.195)。
　　 3.4.Mek1/2抑制劑(U0126)對BTBR小鼠自發(fā)活動情況的影響
　　 應(yīng)用曠場實驗檢測動物的自發(fā)活動情況，結(jié)果顯示三組間的非活動時間(immobiletime)有統(tǒng)計學(xué)差異(F=11.694，P＜0.001)，兩兩之間比較發(fā)現(xiàn)BTBRU0126組與BTBRDMSO組有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.

28、026)。三組間的面壁站立時間(rearingtime)有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.134，P=0.001)，但是BTBRU0126組與BTBRDMSO組沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.198)。三組間的中央停留時間百分比(％centertime)有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.780，P＜0.001)，但是BTBRU0126組與BTBRDMSO組沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.665)。
　　 3.5.Mek1/2抑制劑(U0126)對BTBR小鼠記憶力的

29、影響
　　 條件恐實驗主要用于測試動物的記憶能力，結(jié)果顯示三組間基本的凝滯時間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(F=0.654，P=0.526)，訓(xùn)練后三組間的凝滯時間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(F=0.378，P=0.688);關(guān)聯(lián)階段(context)三組間的凝滯時間有統(tǒng)計學(xué)差異(F=3.404，P=0.045)，BTBRU0126組與BTBRDMSO組沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.656)，B6DMSO組與BTBRDMSO組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.020)，

30、但是B6DMSO組與BTBRU0126組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.054)。變更關(guān)聯(lián)階段(cue)三組間的凝滯時間有統(tǒng)計學(xué)差異(F=12.163，P＜0.001)，BTBRU0126組與BTBRDMSO組沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.825)。
　　 4、Mek1/2抑制劑(U0126)對大腦神經(jīng)系統(tǒng)VGLUTI/VGAT比值、Map2和PSD的影響
　　 4.1.Mek1/2抑制劑(U0126)對大腦神經(jīng)系統(tǒng)VGLUTI/V

31、GAT比值的影響
　　 結(jié)果顯示海馬CA1區(qū)三組間的VGLUTI/VGAT比值有顯著性差異(F=14.534,P＜0.001)，B6DMSO和BTBRU0126間有顯著性差異(P=0.021)，BTBRU0126和BTBRDMSO間有顯著性差異（P=0.003），熒光強度下降24.234％，B6DMSO和BTBRDMSO間有顯著性差異(P＜0.001)，BTBRDMSO的VGLUTI/VGAT比值是B6DMSO的1.748倍。海

32、馬CA3區(qū)三組間的VGLUTI/VGAT比值VGLUTI/VGAT比值沒有顯著性差異(F=2.236，P=0.110)。大腦皮質(zhì)區(qū)三組間的VGLUTI/VGAT比值沒有顯著性差異(F=0.330，P=0.720)。
　　 4.2.Mek1/2抑制劑(U0126)對大腦神經(jīng)系統(tǒng)MAP2表達的影響
　　 結(jié)果顯示海馬CA1區(qū)三組間MAP2熒光強度有顯著性差異(F=89.680,P＜0.001)，B6DMSO和BTBRU012

33、6間有顯著性差異(P＜0.001)，BTBRU0126和BTBRDMSO間有顯著性差異(P＜0.001)，B6DMSO和BTBRDMSO間沒有顯著性差異(P=0.139)。海馬CA3區(qū)三組間的MAP2熒光強度有顯著性差異(F=151.246，＜0.001)，B6DMSO和BTBRU0126間有顯著性差異(P＜0.001)，BTBRU0126和BTBRDMSO間有顯著性差異(P＜0.001)，B6DMSO和BTBRDMSO間沒有顯著性差異

34、(P=0.139)。三組小鼠的大腦皮質(zhì)區(qū)MAP2熒光強度弱，無法檢測。
　　 4.3.Mek1/2抑制劑(U0126)對大腦神經(jīng)系統(tǒng)PSD的影響
　　 結(jié)果顯示海馬CA1區(qū)三組間PSD熒光強度有顯著性差異(F=4.963，P=0.008)，B6DMSO和BTBRU0126間沒有顯著性差異(P=0.930)，BTBRU0126和BTBRDMSO間有顯著性差異(P=0.006)，B6DMSO和BTBRDMSO間有顯著性差異(

35、P=0.008)。海馬CA3區(qū)三組間的PSD熒光強度沒有顯著性差異(F=0.621，P=0.539)。大腦皮質(zhì)區(qū)三組間PSD熒光強度有顯著性差異(F=54.489,P＜0.001)，B6DMSO和BTBRU0126間有顯著性差異(P＜0.001)，BTBRU0126和BTBRDMSO間有顯著性差異(P＜0.001)，B6DMSO和BTBRDMSO間沒有顯著性差異(P＜0.001)。
　　 5.Mek1/2抑制劑(U0126)對大

36、腦皮質(zhì)成熟樹突棘形成的影響
　　 應(yīng)用DiI標記檢測B6DMSO、BTBRU0126和BTBRDMSO三組小鼠大腦組織中的樹突棘的形態(tài)。染色結(jié)果提示，使用U01261治療后，BTBR皮質(zhì)區(qū)成熟樹突棘密度是BTBR未處理組的2倍(P=0.024)，但仍低于B6DMSO組(B6DMSOVSBTBRU0126:P=0.002;B6DMSOVSBTBRDMSO:P＜0.001)
　　 結(jié)論
　　 1.應(yīng)用WesternB

37、lot檢測不同年齡的BTBR小鼠大腦中Erk1/2信號通路的表達情況，發(fā)現(xiàn)新生鼠的Erk1/2信號通路表達明顯升高，3周時表達水平與B6相當，一直持續(xù)到成年。
　　 2.Mek抑制劑對新生小鼠進行腹腔注射，下調(diào)BTBR小鼠大腦的ERK磷酸化水平，行為學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)Mek抑制劑能部分改善BTBR小鼠的社交能力及自發(fā)活動，但焦慮癥狀、重復(fù)刻板動作、學(xué)習(xí)記憶能力未見明顯改變。
　　 3.Mek1/2抑制劑下降Erk1/2活化水平阻