生脈散抑制Ras-MAPK通路過(guò)度激活的機(jī)制研究.pdf

1、Ras蛋白是原癌基因ras的表達(dá)產(chǎn)物，是一種GTPase開關(guān)蛋白，參與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Ras過(guò)度激活導(dǎo)致其下游的有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)級(jí)聯(lián)過(guò)度激活。Ras/MAPK通路的過(guò)度激活與約30％的人類腫瘤密切相關(guān)，并且經(jīng)常伴隨著活性氧（reactive oxygen species, ROS）的過(guò)度累積。因此，開發(fā)下調(diào)Ras通路過(guò)度激活抗腫瘤藥物的可行策略之

2、一是篩選能夠降低ROS含量的候選物。
　　在秀麗隱桿線蟲中，let-60基因與哺乳動(dòng)物ras基因是同源基因，MT2124株系線蟲let-60過(guò)度激活，在線蟲中表現(xiàn)為不正常的腫瘤樣多假陰門表型。前期研究發(fā)現(xiàn)生脈散具有顯著的體內(nèi)外抗氧化作用。故本研究采用秀麗隱桿線蟲MT2124[let-60(gf)/ras]作為腫瘤模型，檢測(cè)生脈散水煎劑（Shengmai-water decoction，SM-WD）是否可抑制Ras/MAPK通路過(guò)度

3、激活及其可能的作用機(jī)制。
　　本研究中測(cè)得1mg/mL生藥量（以下濃度均為生藥量）的SM-WD的體外抗氧化功能相當(dāng)于0.0792mM的維生素E類似物Trolox。并且3.0~12.0 mg/mL SM-WD可濃度依賴地抑制Ras/MAPK通路的過(guò)度激活。因此，我們推測(cè)SM-WD可能是通過(guò)其體外抗氧化作用來(lái)發(fā)揮抑制Ras/MAPK通路的過(guò)度激活。但繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，3.0~12.0 mg/mL的SM-WD可濃度依賴地增加秀麗隱桿線蟲MT

4、2124[let-60(gf)/ras]突變體的脂褐素累積，12.0 mg/mL SM-WD處理MT2124[let-60(gf)/ras]突變體的體內(nèi)總ROS水平和線粒體內(nèi)超氧陰離子（O2?－）水平較空白對(duì)照組分別升高約90%，100%。說(shuō)明SM-WD在MT2124[let-60(gf)/ras]突變體體內(nèi)確實(shí)誘導(dǎo)了氧化脅迫，而非預(yù)期的抗氧化作用。
　　為了研究SM-WD在MT2124[let-60(gf)/ras]突變體體內(nèi)的

5、作用機(jī)制，采用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-cysteine，NAC）清除ROS，及促氧化劑百草枯（Paraquat，PQ）誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，以此來(lái)觀察ROS水平對(duì)SM-WD抑制Ras過(guò)度激活作用的影響。結(jié)果顯示，2.5 mM NAC可完全抵消12.0 mg/mL SM-WD抑制Ras/MAPK通路過(guò)度激活的作用，而0.5 mM PQ不能，提示SM-WD對(duì)Ras/MAPK通路過(guò)度激活的抑制作用并非依賴于其抗氧化作用。此外，

6、采用外源添加150U超氧化物歧化酶（SOD）清除MT2124[let-60(gf)/ras]突變體體內(nèi)O2·－，發(fā)現(xiàn)SOD顯著抵消了12.0 mg/mL SM-WD約80%的作用，說(shuō)明單獨(dú)PQ具有與生脈散類似的功效，故SM-WD抑制Ras過(guò)度激活中，ROS和O2·－發(fā)揮著重要作用。
　　本文還檢測(cè)了SM-WD對(duì)MT2124[let-60(gf)/ras]突變體線蟲的線粒體功能的影響。結(jié)果表明：12.0 mg/mL SM-WD升高了

7、MT2124[let-60(gf)/ras]突變體線蟲的耗氧量、線粒體豐度和游離鈣離子水平，降低了體內(nèi)ATP含量和線粒體膜電位，干擾線粒體呼吸鏈細(xì)胞色素C還原酶的cyc-1基因，可部分抵消SM-WD抑制Ras/MAPK通路的過(guò)度激活。結(jié)果提示SM-WD可通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體的功能抑制Ras的過(guò)度激活，并且該抑制作用需要cyc-1的參與。NAC和PQ不影響SM-WD誘導(dǎo)耗氧量的增加、ATP含量減少和線粒體豐度增加，說(shuō)明SM-WD并非是一個(gè)簡(jiǎn)單的

8、促氧化劑，而是調(diào)節(jié)了線粒體的功能來(lái)誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。
　　本文采用線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（Permeability transition pore，PTP）的其中一個(gè)亞基親環(huán)蛋白D（CypD）的特異性抑制劑5μM環(huán)孢素A（CsA）處理MT2124[let-60(gf)/ras]突變體線蟲，發(fā)現(xiàn)CsA可完全抵消12.0 mg/mL SM-WD降低線粒體膜電位，誘導(dǎo)的O2·－、ROS水平的升高及其抑制Ras過(guò)度激活的作用，而PTP的另外兩

9、個(gè)亞基腺嘌呤核苷酸移位酶（ANT）和電壓依賴性陰離子通道（VDAC）的特異性抑制劑米酵菌酸（BA，8μM）和4,4’-二巰基反苯代乙烯基2,2’-二磺酸二鈉鹽水合物（DIDS，500μM）沒(méi)有這種抑制作用。其次，采用抗氧劑NAC清除ROS后，不影響SM-WD誘導(dǎo)的PTP的開放。結(jié)果提示，SM-WD是通過(guò)調(diào)節(jié)CypD促使PTP開放，PTP的開放增加了ROS的累積，引起氧化脅迫，最終抑制了 Ras的過(guò)度激活。本文結(jié)果顯示 SM-WD還可濃度

10、依賴地顯著誘導(dǎo) MT2124[let-60(gf)/ras]突變體線蟲生殖腺細(xì)胞的凋亡。
　　P53，JNK/MAPK和p38/MAPK這三條通路均與氧化脅迫相關(guān)，并且參與細(xì)胞的增殖等過(guò)程。因此，本文采用RNAi技術(shù)干擾cep-1（p53同源基因），jnk-1（JNK同源基因）， pmk-1（p38同源基因），探討這三條通路是否參與SM-WD對(duì)Ras過(guò)度激活的抑制。結(jié)果表明，分別干擾cep-1，jnk-1，pmk-1基因后都部分抵

11、消了12.0 mg/mL SM-WD對(duì)Ras過(guò)度激活的抑制作用。并且12.0 mg/mL SM-WD可顯著抑制ERK和p-ERK的表達(dá)，促進(jìn)CEP-1、JNK、p-JNK和p38、p-p38的表達(dá)，并且CEP-1、JNK和p38均促進(jìn)了12.0 mg/mL SM-WD對(duì)ERK和p-ERK的抑制作用，說(shuō)明SM-WD對(duì)Ras過(guò)度激活的抑制需要P53， JNK/MAPK和p38/MAPK這三條通路參與。
　　最后，本文研究還發(fā)現(xiàn)3.0~

12、12.0 mg/mL SM-WD可濃度依賴地誘導(dǎo)野生型背景線蟲的DAF-16核轉(zhuǎn)位，其下游的GST-4、SOD-1、SOD-3、HSP-16.2的表達(dá)水平也顯著升高。說(shuō)明在野生型背景下SM-WD顯著誘導(dǎo)了抗氧化系統(tǒng)的激活。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SM-WD在Ras過(guò)度激活的背景下可通過(guò)調(diào)節(jié)CypD誘導(dǎo)PTP開放，誘導(dǎo)氧化脅迫，最終抑制 Ras/MAPK通路的過(guò)度激活抗腫瘤。這些研究結(jié)果為SM-WD作為潛在的抗腫瘤藥物候選物提供了