吸煙相關(guān)性牙周炎中α7 nAChR-ERK1-2-c-Fos通路的研究.pdf

1、吸煙是牙周炎的主要影響因素,吸煙者牙周炎患病率高,病情重,治療效果及預(yù)后較差。煙草中的尼古丁被證實在牙周組織的破壞過程中發(fā)揮重要作用,但作用機制尚不明了。課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):大鼠和人類的牙周組織中存在煙堿型乙酰膽堿受體α7亞型(α7nAChR)的功能性表達(dá),尼古丁作用人牙周膜細(xì)胞和實驗性牙周炎大鼠后α7nAChR表達(dá)升高,這一效應(yīng)可被特異性拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素(α-BTX)所拮抗。ERK1/2通路是各種細(xì)胞外刺激信號引起細(xì)胞增殖分化

2、的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的交匯點,有實驗證實在牙齦上皮細(xì)胞中尼古丁可結(jié)合α7nAChR,激活下游ERK信號通路,上調(diào)炎性因子的表達(dá)。c-Fos作為ERK的下游靶基因,它們互相協(xié)同作用,參與了細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控。研究證實c-Fos在多種細(xì)胞調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的過程中起到了極其重要的作用。這些研究成果為我們研究尼古丁在牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用提供了新的思路:尼古丁作用于人牙周膜細(xì)胞膜(hPDLCs)后是否會通過α7nAChR,激活下游ERK1/2信號

3、通路ERK1/2信號通路激活后其下游c-Fos基因的表達(dá)是否同樣會升高?本實驗擬通過探討α7nAChR,ERK1/2信號通路及c-Fos在吸煙相關(guān)性牙周炎中的相互關(guān)系,了解人牙周膜細(xì)胞中α7nAChR被尼古丁激活后具體的效應(yīng)機制,為吸煙相關(guān)性牙周炎的防治提供一定的理論依據(jù)。
　　實驗一改良組織塊法培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞
　　1.材料與方法
　　取12~16歲青少年因正畸拔除的健康無齲第一前磨牙,無菌條件下采用組織塊法行原代培

4、養(yǎng);待組織塊周圍爬出細(xì)胞并增殖到一定密度后,常規(guī)傳代,第5代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。
　　2.結(jié)果
　　原代培養(yǎng)7天左右,組織塊邊緣陸續(xù)有成纖維樣細(xì)胞爬出。常規(guī)傳代,鏡下觀察第5代細(xì)胞,見其呈長梭形,輪廓清晰,貼壁生長,排列呈放射狀,胞漿均勻豐滿,核仁呈圓形且清晰。
　　3.結(jié)論
　　體外成功培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞,建立用于實驗的細(xì)胞模型。
　　實驗二尼古丁和/或α-BTX對人牙周膜細(xì)胞中c-Fos表達(dá)的影響
　

5、　1.材料與方法
　　選取第5代人牙周膜細(xì)胞接種于六孔板,通過反轉(zhuǎn)錄PCR實驗觀察α7nAChR激動劑尼古丁在不同時間和濃度作用人牙周膜細(xì)胞后c-FosmRNA的表達(dá)變化。通過RT-PCR及Westernblot檢測各組細(xì)胞在尼古丁(10-5M)和/或α-BTX(10-8M)作用后c-FosmRNA及蛋白的變化。
　　2.結(jié)果
　　反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果表明:10-4M尼古丁作用于人牙周膜細(xì)胞1h后c-Fos的基因表達(dá)最高,

6、結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),考慮尼古丁劇毒性,采用10-5M濃度尼古丁用于后續(xù)實驗。RT-PCR及Westernblot結(jié)果表明尼古丁(10-5M)作用人牙周膜細(xì)胞1h后,明顯上調(diào)c-FosmRNA和蛋白表達(dá),而α-BTX(10-8M)可顯著拮抗此過程,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.結(jié)論
　　根據(jù)濃度梯度和時間梯度實驗,選取10-5M濃度尼古丁和1小時作為后續(xù)實驗的實驗濃度和時間。進一步證實,尼古丁可能通

7、過作用于α7nAChR調(diào)節(jié)人牙周膜細(xì)胞中c-Fos的活性。
　　實驗三ERK1/2信號通路對吸煙相關(guān)性牙周炎中c-Fos表達(dá)的調(diào)控作用
　　1.材料與方法
　　選取第5代人牙周膜細(xì)胞接種于六孔板,分別給予α7nAChR激動劑尼古丁(10-5M)和/或拮抗劑α-BTX(10-8M),通過Westernblot檢測ERK1/2的磷酸化水平。另取相同細(xì)胞模型,分別給予尼古丁(10-5M)和/或ERK1/2拮抗劑U0126(1

8、0-5M),RT-PCR及Western-blot檢測c-FosmRNA和蛋白的表達(dá)情況。
　　2.結(jié)果
　　實驗結(jié)果表明:與對照組相比,10-5M尼古丁可使人牙周膜細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平明顯增強,10-8Mα-BTX可顯著降低這一作用,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);ERK1/2拮抗劑U0126可明顯拮抗尼古丁對c-Fos活性的升高作用,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.結(jié)論
　　ERK1/2通