流感病毒及其M2離子通道蛋白對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)控研究.pdf

1、流感病毒是重要的人類呼吸道病原體，可引起季節(jié)性流行和全球性大爆發(fā)。2013年3月，中國東部省份出現(xiàn)新型H7N9禽流感病毒，人們不禁擔(dān)心H7N9是否會(huì)引起大范圍疫情爆發(fā)。流感病毒的重要特點(diǎn)是能夠?qū)λ拗骷?xì)胞的各種通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，但是在病毒-宿主相互作用中的病毒成分和其作用機(jī)理卻不是特別清楚。
　　自噬是細(xì)胞內(nèi)由膜介導(dǎo)的降解過程，雙層膜自噬體的出現(xiàn)是自噬的重要標(biāo)志。細(xì)胞質(zhì)中的長壽命蛋白和受損的細(xì)胞器可通過自噬體被運(yùn)輸至溶酶體降解。自噬影響

2、多種生理和病理過程如發(fā)育、癌癥和感染性疾病。近年來研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染可對(duì)自噬過程產(chǎn)生影響，流感病毒在體外和體內(nèi)可引起自噬體堆積，但是流感病毒如何影響自噬和其作用機(jī)理仍然存在爭論。
　　利用流感病毒A/Hong Kong/8/68(H3N2)和A/WS/33(H1N1)感染細(xì)胞發(fā)現(xiàn)流感病毒可引起細(xì)胞自噬體標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ蛋白的大量堆積，通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)流感病毒也可以引起GFP-LC3融合蛋白的大量堆積。在所用的兩株病毒中A

3、/Hong Kong/8/68(H3N2)為金剛烷胺敏感株而A/WS/33(H1N1)為金剛烷胺耐藥株。當(dāng)用流感病毒M2蛋白離子通道抑制劑金剛烷胺處理流感病毒感染細(xì)胞時(shí)，金剛烷胺可抑制敏感型流感病毒引起的自噬體堆積但對(duì)耐藥型流感病毒引起的自噬體堆積沒有影響。流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑奧司他韋對(duì)流感病毒引起的自噬體堆積也沒有影響。這些結(jié)果表明，流感病毒引起自噬體堆積依賴于其M2蛋白離子通道活性。
　　利用H5N1和H7N9流感病毒的M

4、2蛋白來進(jìn)一步研究M2蛋白離子通道活性是否可以引起自噬體堆積。金剛烷胺敏感型H5N1-M2(WT)和金剛烷胺耐藥型H5N1-M2(S31N)蛋白表達(dá)后可引起自噬體堆積，但金剛烷胺只能抑制H5N1-M2(WT)引起的自噬體堆積而不能抑制H5N1-M2(S31 N)引起的自噬體堆積。同樣，H7N9-M2和其金剛烷胺敏感型突變體H7N9-M2(N31S)蛋白表達(dá)后也可以引起自噬體堆積，但金剛烷胺只能抑制H7N9-M2(N31S)引起的自噬體堆

5、積而不能抑制H7N9-M2引起的自噬體堆積。結(jié)果表明，M2蛋白單獨(dú)表達(dá)可以引起細(xì)胞自噬體堆積，且此過程與M2蛋白的離子通道活性直接相關(guān)。
　　自噬過程除了出現(xiàn)具有標(biāo)志性的自噬體外，自噬體還要與溶酶體融合形成自噬溶酶體才能完成整個(gè)過程。通過GFP-LC3融合蛋白和溶酶體標(biāo)志分子LAMP2熒光共定位發(fā)現(xiàn)，M2蛋白引起的自噬體與溶酶體不能融合而形成自噬溶酶體。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，M2蛋白可引起自噬底物蛋白P62蛋白聚集在自噬體上，并且M2蛋

6、白可通過其離子通道活性來抑制P62蛋白的降解。同樣，流感病毒感染也可抑制自噬體與溶酶體融合而形成自噬溶酶體并抑制自噬底物蛋白P62蛋白的降解。這些結(jié)果表明，流感病毒M2蛋白可以抑制自噬溶酶體的形成并抑制自噬降解途徑。
　　流感病毒M2蛋白為H+離子通道蛋白，可定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體中并破壞這些內(nèi)膜系統(tǒng)的PH值。研究表明，自噬體膜主要來自細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等內(nèi)膜系統(tǒng)。我們利用熒光共定位發(fā)現(xiàn)，M2蛋白也定位于自噬膜上。因此，流感