腸道病毒71型VP1-VP4在重組腺病毒系統(tǒng)中的表達(dá)及免疫學(xué)評(píng)價(jià).pdf

1、腸道病毒71型（Enterovirus71，EV71）是導(dǎo)致嬰幼兒感染的重要病原之一，可引起多種疾病，具有較廣的疾病譜。其中由EV71引起的兒童手足口?。℉and，F(xiàn)oot，and Mouth Disease，HFMD）最為常見，而且在嬰幼兒容易造成腦干腦炎等神經(jīng)系統(tǒng)感染導(dǎo)致死亡。EV71近年有多地區(qū)流行的趨勢(shì)。
　　 EV71在分類上屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，基因組為正鏈單股RNA?；蚪M全長(zhǎng)7500bp，編碼區(qū)僅有一個(gè)開

2、放閱讀框（ORF），編碼約2200個(gè)氨基酸的多聚蛋白（Polyprotein），該多聚蛋白可進(jìn)一步被水解成P1、P2、P3三個(gè)前體蛋白，P1蛋白在3CD蛋白酶的切割作用下生成VP1、VP2、VP3與VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白。其中VP1、VP2和VP3裸露于病毒顆粒的表面，VP4位于病毒顆粒衣殼內(nèi)側(cè)與基因組RNA緊密連接，共同構(gòu)成EV71的抗原區(qū)。研究資料表明，雖然該病毒主要抗原決定區(qū)位于VP1，但是VP2、VP3以及VP4上均有抗原抗體結(jié)合功

3、能；已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示單獨(dú)的VP1和VP3免疫原性有限，若能獲得VP1～VP4，免疫原性將會(huì)得到明顯提高。
　　 鑒于此，我們首先對(duì)從流行區(qū)分離的EV71病毒進(jìn)行了血清學(xué)和分子生物學(xué)方面的鑒定，采用RT-PCR的方法克隆了P1和3CD基因，借助于載體pcDNA3.0BA構(gòu)建雙順反子穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-P1-3CD和單基因的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-P1與pShuttle-CMV-3CD。經(jīng)同源重組獲得了重組

4、腺病毒質(zhì)粒rAd-P1-3CD、rAd-P1、rAd-3CD，分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝，獲得相應(yīng)的重組腺病毒rAd-P1-3CD、rAd-P1和rAd-3CD，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)表明，三個(gè)重組腺病毒均已轉(zhuǎn)錄目的基因mRNA；免疫熒光和免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明僅雙順反子重組腺病毒rAd-P1-3CD中可檢測(cè)到特異性目的蛋白，而rAd-P1、rAd-3CD中未能檢測(cè)到特異性的表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果表明重組腺病毒可有效表達(dá)EV71 P1和3CD基因，僅

5、含P1或3CD基因的重組腺病毒表達(dá)產(chǎn)物未能被特異性抗體所識(shí)別，而含P1及3CD蛋白酶基因的雙順反子重組腺病毒表達(dá)產(chǎn)物具有EV71特異抗原性，提示P1蛋白只有在3CD蛋白酶的切割作用下才具有抗原性；重組腺病毒通過滴鼻、灌胃和皮下注射的方式分別免疫BALB/C小鼠，ELISA法檢測(cè)結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中均檢測(cè)到抗EV71特異性IgG的抗體，且由rad-P1-3CD免疫后產(chǎn)生的抗體水平明顯高于rAd-P1和rAd-3CD共免疫產(chǎn)生的抗體水

6、平；三種不同的免疫方式結(jié)果證明，灌胃免疫方式最佳，滴鼻次之，皮下注射產(chǎn)生的抗體水平最低。目前有限次數(shù)的中和試驗(yàn)還未能在實(shí)驗(yàn)組血清中檢測(cè)到EV71特異性保護(hù)作用，其原因還有待進(jìn)一步研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)成功克隆了包含EV71全部結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)基因P1和具有切割作用的蛋白酶3CD，初步探索了EV71病毒蛋白之間的相互作用，為研究EV71結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白之間的關(guān)系打下了基礎(chǔ)；為找尋最合理的相關(guān)重組腺病毒疫苗的免疫方式做了初步的探索實(shí)驗(yàn)，