K6W泛素抑制兔后發(fā)性白內(nèi)障.pdf

1、第一部分：重組負顯性K6W泛素腺病毒顆粒擴增純化及滴度檢測目的：利用QBI-HEK 293A細胞擴增重組負顯性K6W泛素腺病毒顆粒(RAd-K6W)、重組負顯性K6W泛素．綠色熒光蛋白腺病毒顆粒(RAd-K6W／GFP)和野生型腺病毒顆粒，純化并檢測三者病毒滴度。 方法：利用QBI-HEK 293A細胞大量擴增病毒，待細胞出現(xiàn)細胞病理效應(cell pathology effect，CPE)時收集細胞，反復凍融3次取上清。通過

2、連續(xù)和不連續(xù)氯化銫密度梯度離心去除細胞污染物和缺陷性病毒再進行透析，得到可以用于體內(nèi)的病毒原液并檢測病毒滴度。 結果：病毒感染QBI-HEK 293A細胞出現(xiàn)CPE， RAd-K6W和RAd-K6W／GFP組的細胞生長速度和病毒擴增速度均慢于空病毒載體組，RAd-K6W、RAd-K6W／GFP和空病毒載體最終滴度分別為1.44×108(ifu)／mL、1.41×108(ifu)／mL和2.07×109(ifu)／mL。

3、結論：RAd-K6W、RAd-K6W／GFP和空病毒載體均通過QBI-HEK 293A成功擴增，在擴增過程中K6W泛素可能起抑制QBI-HEK 293A增殖的作用。 第二部分：重組負顯性K6W泛素-GFP腺病毒顆粒轉(zhuǎn)染兔晶狀體上皮細胞的觀察 目的：建立兔后發(fā)性自內(nèi)障模型，前房注射RAd-K6W／GFP病毒原液后觀察，證明其可以成功轉(zhuǎn)染兔晶狀體上皮細胞并確定注射用量。 方法：取4只新西蘭家兔行右眼超聲乳化晶狀體吸除

4、術，術后切口水密縫合，前房分別注射含1uL、2uL、4uL、8 uL RAd-K6W／GFP病毒原液的稀釋液0.5mL，48h后處死，分離囊膜在共聚焦顯微鏡下觀察GFP表達。3只新西蘭家兔術后前房注射含8uL RAd-K6W／GFP病毒原液病毒原液的稀釋液0.5mL,分別在術后48h、7d、19d觀察GFP表達情況。1只新西蘭家兔術后雙眼前房注射同等量RAd-K6W和空病毒載體，48h后分離囊袋用免疫印記法檢測泛素表達量。 結果

5、：前房注射48h后，GFP即明顯表達，泛素表達量也明顯上調(diào)。轉(zhuǎn)染效率隨病毒量增加而升高，8uL組轉(zhuǎn)染效率約為90％～95％。RAd-K6W／GFP攜帶的GPF表達隨時間改變：病毒前房注射48h后即表達明顯；7d后大部分細胞表達GFP；19d后表達幾乎消失。 結論：RAd-K6W／GFP可成功轉(zhuǎn)染兔后發(fā)性白內(nèi)障模型的晶狀體上皮細胞，腺病毒攜帶的外源性基因只表達1～2w。 第三部分：K6W泛素對兔后發(fā)性白內(nèi)障的影響

6、目的：形態(tài)學評價RAd-K6W對兔后發(fā)性白內(nèi)障的影響。 方法：新西蘭家兔24只隨機分為4組，行雙眼晶狀體超聲乳化吸除術，前房分別注射不同液量的RAd-K6W和空病毒載體稀釋液0.5mL。另取2只術后注射世可平衡液作為空白對照。術后1d、3d、5d、7d、13d、15d散瞳后用裂隙燈拍照系統(tǒng)拍攝后囊膜渾濁情況，并采用POCOman軟件進行半定量分析，并用非接觸式眼壓計檢測眼壓、評價角膜渾濁程度。 結果：第一組雙眼PCO評分

7、無統(tǒng)計學差異；第二組術后1d、3d、5d、7d雙眼PCO評分無統(tǒng)計學差異，11d、15d有統(tǒng)計學差異；第三組術后1d、3d雙眼PCO評分無統(tǒng)計學差異，5d、7d、11d、15d有統(tǒng)計學差異；第四組出現(xiàn)角膜內(nèi)皮水腫，2w后逐漸恢復透明。角膜渾濁在3d、7d有統(tǒng)計學差異。眼壓第3、7d雙眼眼壓有統(tǒng)計學差異，K6W組高于對照組；第1、11、15d雙眼眼壓無統(tǒng)計學差異。 結論：達到適當轉(zhuǎn)染效率的RAd-K6W對兔后發(fā)性白內(nèi)障有抑制作用。

8、過量表達K6W泛素可導致角膜內(nèi)皮水腫、眼壓升高的毒性作用。 第四部分：K6W泛素對兔晶狀體上皮細胞特征性蛋白表達的影響 目的：進一步觀察RAd-K6W對兔晶狀體上皮細胞特征性蛋白表達的影響。 方法：第三組新西蘭家兔2只術后15d處死分離囊袋，用免疫印記法檢測α-平滑肌肌動蛋白的表達；免疫熒光檢測α-平滑肌肌動蛋白的表達。 結果:RAd-K6W轉(zhuǎn)染15d后增殖的晶狀體上皮細胞α-平滑肌肌動蛋白的表達較對照組