GLP-1對人肝細(xì)胞糖原合成酶活性的影響及其與MAPK信號通路的研究.pdf

1、目的:
　　 1.體外培養(yǎng)人肝細(xì)胞L02細(xì)胞系。
　　 2.研究胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)在人肝細(xì)胞L02細(xì)胞系的糖原合成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路-MAPK通路。
　　 3.為GLP-1的擬胰島素作用及其相關(guān)藥物的臨床應(yīng)用的安全性和有效性提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.體外培養(yǎng)人肝細(xì)胞L02細(xì)胞系,通過倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察。
　　 2.實(shí)驗(yàn)分兩部分:
　　 (1)第一部分:MTT

2、方法檢查GLP-1、INS對肝細(xì)胞存活數(shù)量的影響,是否有疊加作用。
　　 (2)第二部分:蛋白質(zhì)印跡(western blot)檢查來驗(yàn)證GLP-1對肝細(xì)胞糖原-合成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路-MAPK通路的影響。分組為:Ctrl組,GLP-1(10nmol/l)組,GLP-1(10nmol/l)+PD98059組(25μmol/l),PD98059(25μmol/l)組,INS(10nmol/l)組,GLP-1+INS(10nmol/l)組

3、。
　　 3.western blot測定磷酸化糖原合成酶(p-GS)和糖原合成酶(GS)的表達(dá)。
　　 4.通過western blot測定的P-GS與GS的表達(dá)量的光密度比值測定糖原合成酶的活性。
　　 結(jié)果:
　　 1.人肝L02細(xì)胞的傳代培養(yǎng)情況良好。
　　 2.GLP-1組、INS組、GLP-1+INS聯(lián)合組的OD值均明顯高于Ctrl組,而GLP-1+INS聯(lián)合組OD值又明顯高于GLP-

4、1組、INS組。表明INS、GLP-1可以促進(jìn)肝細(xì)胞的生長,且這種作用可以疊加。
　　 3.western blot結(jié)果示:與Ctrl組相比,INS組、GLP-1組的磷酸化糖原合成酶(p-GS)表達(dá)有明顯減少。GLP-1組與GLP-1+PD組相比有明顯的差異。GLP-1+INS與Ctrl組、GLP-1組、INS組比較p-GS表達(dá)明顯減少。表明INS、GLP-1均可促進(jìn)P-GS向GS的轉(zhuǎn)化,且這種作用可以疊加。MAPK阻斷劑PD部

5、分阻斷了GLP-1的這一作用。
　　 4.western blot表明,與Ctrl組相比GLP-1組、INS組的糖原合成酶(GS)表達(dá)有明顯增加。GLP-1組與GLP-1+PD組相比有明顯的差異,表明MAPK特異性阻斷劑PD部分阻斷了GLP-1促進(jìn)GS表達(dá)的作用。GLP-1+INS與Ctrl組、GLP-1組、INS組比較GS表達(dá)明顯增高。表明INS、GLP-1可以促進(jìn)糖原合成酶的表達(dá),且這種作用可以疊加。
　　 5.用P

6、-GS/GS的比值來表示GS的活性,比值越大,GS的活性越低。結(jié)果顯示,與Ctrl組相比,GLP-1組、INS組、GLP-1+INS組GS的活性均明顯提高；表明INS、GLP-1可以增加GS的活性。GLP-1組、INS組與兩者聯(lián)合組比較,GS的活性較低,表明INS、GLP-1組聯(lián)合對GS活性的增加有疊加作用。與GLP-1組相比,GLP-1+PD98059組的GS的活性明顯降低,表明MAPK阻斷劑PD部分阻斷了GLP-1促進(jìn)GS活性增加的

7、作用。
　　 結(jié)論:本研究通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)GLP-1、INS均能促進(jìn)人肝L02細(xì)胞系的生長,GLP-1和INS聯(lián)合應(yīng)用對其生長具有疊加作用。INS,GLP-1可直接作用于人肝細(xì)胞,促進(jìn)失活狀態(tài)的磷酸化的GS轉(zhuǎn)化為具有活性的GS,上調(diào)糖原合成酶的表達(dá),從而增加肝細(xì)胞中GS的活性來促進(jìn)糖原合成。且這種作用可以疊加。MAPK抑制劑能夠阻斷GLP-1在肝細(xì)胞中介導(dǎo)的糖原合成酶的上調(diào)表達(dá)和糖原合成酶活性的增加,表明MAPK通路可能對GLP