人參皂苷Rb1通過抑制L-型電壓門控鈣通道的活性改善Aβ-,25-35-誘導的海馬神經元鈣平衡紊亂.pdf

1、本研究擬從上述這兩方面來探討Rb1對鈣超載影響的可能機制。 方法：應用全細胞膜片鉗技術通過設定的不同刺激方案記錄原代培養(yǎng)7d海馬神經元上的電壓門控的鈣通道電流(voltage-gated calcium channel current，VGCC)。利用細胞外灌流、細胞內液給藥及預孵育等給藥方式，同時分別應用各型鈣通道特異性阻斷劑或各種蛋白激酶的抑制劑，通過比較加藥前后或不同組間電流幅度的變化探討Aβ25-35對VGCC的調控及R

2、b1對Aβ25-35誘導的鈣內流的作用機制。預先用鈣高度特異性熒光探針Fluo-3/AM負載海馬神經元，進行熒光染色，利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察在不同藥物干預條件下海馬神經元內游離鈣離子熒光強度的變化探討Aβ25-35對內質網鈣庫調控及Rb1對Aβ25-35誘導的內質網鈣庫釋放的影響。 結果：(1)在原代培養(yǎng)的海馬神經元上存在多種的鈣電流成分(L、N、P/Q、T等)，它們具有各自不同的藥理學及動力學特性；急性給予10μmolL

3、-I凝聚態(tài)Aβ25-35對VGCC沒有影響；10μmoIL-1凝聚態(tài)Aβ25-35預孵育3、6、12、24h后，各組電流均較對照組有不同程度的增加，并以預孵育3h記錄到的高電壓激活的鈣電流( HVA-Ica)變化為著，而預孵育對細胞的膜電容沒有影響。(2)L-型鈣通道的特異性抑制劑nifedipine完全抑制了凝聚態(tài)Aβ25-35誘導的Ca2+通道電流的增加；N型鈣通道特異性抑制劑ω-conotoxin GVIA及P/Q型通道特異性的抑

4、制劑ω-agatoxin IVA均無法完全抑制凝聚態(tài)Aβ25-35誘導的Ca2+通道電流的增加。PKA抑制劑H-89部分抑制了Ap預孵育組的電流，而MAPK抑制劑PD98059無法抑制Aβ誘導的電流的增大。(3)2、10、20μM各濃度組凝聚態(tài)Aβ25-35均增加了海馬神經元胞內[Ca2+]i；IP3R的特異性抑制劑2-APB明顯地抑制了胞內[Ca2+]i的增加，蘭尼鹼受體(RyR)的特異性抑制劑dantrolene卻無法抑制。Aβ25

5、-35作用1h后內質網鈣容量即有明顯下降，在作用24h后降低更為明顯。在無細胞外鈣情況下，磷脂酶C的抑制劑U73122部分抑制了Aβ25-35誘導的胞內[Ca2+]i的增加。(4)人參皂苷Rb1可以濃度依賴性的方式抑制海馬神經元上VGCC，并且抑制了Aβ25-35誘導的VGCC。Nifedipine完全阻斷了之前1βMRb41對Aβ25-35誘導的VGCC的抑制，而ω-conotoxin-GVIA、ω-agatoxin IVA等作用前后

6、1μMRb1對Aβ25-35誘導的VGCC的抑制作用沒有受到影響；Rb1使Aβ25-35作用的穩(wěn)態(tài)失活曲線向左即超極化方向偏移，而對Aβ25-35誘導的VGCC的激活特性沒有影響；cAMP的類似物Forskolin并沒有消除10μM Rb1對VGCC的抑制，Rb1對Aβ25-35誘導的VGCC的抑制率亦沒有被PKA/PKC抑制劑staurosporine所影響。在無細胞外鈣情況下，各濃度組Rb1不能抑制Aβ25-35誘導的細胞內鈣熒光強

7、度的增強。 結論：凝聚態(tài)Aβ25-35可通過PKA系統(tǒng)對細胞膜上特定的鈣通道進行磷酸化調控增大VGCC。Aβ25-35可通過IP3途徑產生IP3作用于IP3R而引起內質網鈣的釋放，磷脂酶C的活化可能參與了上述過程。人參皂苷Rb1是一種鈣通道阻滯劑，它通過選擇性地作用于L-型電壓門控的鈣通道，影響鈣通道的失活過程，即通過加速通道向失活態(tài)的轉化抑制通道的活性從而抑制了Aβ25-35誘導的VGCC。Rb1對Aβ25-35誘導的細胞內鈣