人ⅡA型磷脂酶A2的進(jìn)化和衍生多肽抗菌作用的研究.pdf

1、第一節(jié)不同生物ⅡA型磷脂酶A2的分子進(jìn)化
　　實(shí)驗(yàn)一靈長(zhǎng)類生物ⅡA型磷脂酶A2分子進(jìn)化的研究
　　目的:分析親緣關(guān)系密切，但又分屬不同種類的靈長(zhǎng)類生物ⅡA型磷脂酶A2基因的相關(guān)情況，了解ⅡA型磷脂酶A2分子進(jìn)化的一些特點(diǎn)。
　　方法:收集已知的靈長(zhǎng)類生物人(Homo sapiens)、猩猩(Pan troglodytes)和猴(Macaca mulatta)的ⅠB型和ⅡA型磷脂酶A2(phospholipase A2，

2、PLA2)的基因和mRNA順序資料，對(duì)兩型PLA2進(jìn)行堿基替代的相關(guān)分析，包括轉(zhuǎn)換和顛換、顛換/轉(zhuǎn)換比;堿基替代發(fā)生在編碼區(qū)和非編碼區(qū)的情況;以及替代發(fā)生在密碼子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ位上的情況等。
　　結(jié)果:靈長(zhǎng)生物PLA2編碼區(qū)基因發(fā)生堿基替代時(shí)，ⅠB型和ⅡA型PLA2堿基總替代數(shù)在發(fā)生人和猩猩之間最少，而人和猴、猴和猩猩之間則堿基替代明顯增多，約為前者的5倍和3倍多;ⅠB型PLA2堿基替代在人和猩猩之間以密碼子Ⅰ、Ⅲ位最多，各占40％，

3、第Ⅱ位者最少占20％;而在人和猴、猴和猩猩之間按替代頻率高低依次為Ⅲ＞Ⅱ＞Ⅰ位，發(fā)生于第Ⅰ、Ⅱ位的總堿基替代百分率為48％～50％，低于發(fā)生于第Ⅲ位的50％～52％;人和猴、猴和猩猩之間堿基轉(zhuǎn)換和顛換的比值＞1，而人和猩猩之間比值＜1。與ⅠB型PLA2相比，ⅡA型PLA2在三種靈長(zhǎng)生物之間的堿基總替代數(shù)更多(62 vs54)，堿基替代在密碼子中所占的比例也更高;人、猴和猩猩三者之間的堿基替代均以密碼子第Ⅲ位最多，占40.7％～50％，發(fā)

4、生于Ⅰ、Ⅱ位者在25.9％～33.3％之間，但Ⅰ、Ⅱ位兩個(gè)位點(diǎn)總的堿基替代率達(dá)55.5％～59.2％，明顯高于發(fā)生于第Ⅲ位者;突變的性質(zhì)方面，人和猩猩、猴和猩猩之間堿基轉(zhuǎn)換多于顛換，而人和猴之間則相反，顛換略多于轉(zhuǎn)換。在非編碼區(qū)5'端在人和猩猩間ⅠB型PLA2沒有堿基替代，而ⅡA型PLA2則有2處轉(zhuǎn)換，且人和猴、猴和猩猩之間總替代數(shù)達(dá)60多次，其中顛換明顯多于轉(zhuǎn)換，人和猴、猩猩三者之間的堿基總替代以及轉(zhuǎn)換和顛換占5'端堿基數(shù)的百分比明顯

5、高于ⅠB型。在非編碼區(qū)3'端，ⅠB型PLA2在三種靈長(zhǎng)生物之間均有1次顛換，人和猩猩之間無堿基轉(zhuǎn)換，而人和猴、猴和猩猩之間各有4次和5次轉(zhuǎn)換，且堿基轉(zhuǎn)換無論數(shù)目還是比例都多于顛換。ⅡA型PLA2在三種靈長(zhǎng)生物之間的堿基總替代數(shù)高于ⅠB型，并且人和猩猩、人和猴之間總替代數(shù)及顛換數(shù)占3'端堿基數(shù)的百分比也明顯高于ⅠB型。
　　結(jié)論:1.ⅡA型PLA2分子具有較快的進(jìn)化速度，存在加速進(jìn)化現(xiàn)象;2.ⅡA型PLA2加速進(jìn)化可能與協(xié)同進(jìn)化有關(guān)

6、。
　　實(shí)驗(yàn)二中國(guó)人不同個(gè)體間ⅡA型磷脂酶A2 cDNA擴(kuò)增和順序分析
　　目的:研究中國(guó)人不同個(gè)體間ⅡA型磷脂酶A2(phosphol ipase A2，PLA2)cDNA和氨基酸順序的情況，并與已知外國(guó)人種的ⅡA型PLA2進(jìn)行比較，了解人ⅡA型PLA2分子的進(jìn)化特點(diǎn)。
　　方法:12名因急性或慢性闌尾炎急性發(fā)作施行闌尾切除手術(shù)的患者，取其手術(shù)切除的闌尾炎癥組織50～100mg，以Trizol試劑法勻漿提取總RNA，

7、利用RT-PCR方法分別擴(kuò)增其Ⅱ A型PLA2 cDNA，經(jīng)電泳確認(rèn)條帶清晰的PCR產(chǎn)物送專業(yè)測(cè)序公司行DNA雙向測(cè)序，分析測(cè)序所獲得的DNA及由其推導(dǎo)的氨基酸順序，并與已知外國(guó)人種ⅡA型PLA2的進(jìn)行比較，觀察堿基和氨基酸取代情況，結(jié)合測(cè)序圖譜，分析其分子進(jìn)化的特點(diǎn)。
　　結(jié)果:從12名不同中國(guó)人個(gè)體的闌尾炎癥組織順利擴(kuò)增得到ⅡA型PLA2cDNA，并推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸順序，與已知外國(guó)人種的相比較，發(fā)現(xiàn):①擴(kuò)增得到的ⅡA型PLA

8、2 cDNA順序與已知外國(guó)人種的基本一致;但存在單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide polymorphism，SNPs)。對(duì)測(cè)序圖譜的分析發(fā)現(xiàn)，在12例樣本中有2例可見突變的單等位基因SNPs位點(diǎn)，分別位于密碼子32位和44位，且都發(fā)生在突變熱點(diǎn)CpG二核苷酸位點(diǎn)上，并存在雜合(CG&CT)和純合現(xiàn)象。②由ⅡA型PLA2 cDNA推導(dǎo)的氨基酸順序與已知外國(guó)人種的完全一致。
　　結(jié)論:①中國(guó)人不同個(gè)體間ⅡA型磷脂酶A

9、2的cDNA順序高度保留，與已知其他人種也一樣。多態(tài)性位點(diǎn)發(fā)生在密碼子32和44位上，且都發(fā)生在突變熱點(diǎn)CpG二核苷酸位點(diǎn)上;②中國(guó)人種ⅡA型磷脂酶A2分子一級(jí)結(jié)構(gòu)與其他人種完全一致，說明這一在宿主天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的分子在不同人種間高度保留。
　　實(shí)驗(yàn)三人ⅡA型磷脂酶A2的cDNA片段與嬰兒利什曼原蟲DNA相似性分析
　　目的:了解人ⅡA型磷脂酶A2 cDNA片段和嬰兒利什曼原蟲DNA相似性的情況和原因。
　

10、　方法:搜索NCBI網(wǎng)站基因庫(kù)并獲取人ⅡA型磷脂酶cDNA資料，然后利用BLAST軟件，以人ⅡA型磷脂酶cDNA順序中的片段以每相鄰20個(gè)堿基(bp)為一組（如1-20;10-30;20-40…，以此類推直至結(jié)尾），作為查詢序列與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行逐一比對(duì)，將獲得的一致性片段進(jìn)行收集、整理并分析、匯總利什曼原蟲DNA的相關(guān)信息。
　　結(jié)果:發(fā)現(xiàn)當(dāng)DNA片段長(zhǎng)度≥17bp，人ⅡA型磷脂酶A2 cDNA與嬰兒利什曼原蟲DNA之間僅有4個(gè)片

11、段一致;而在片段長(zhǎng)度≥16bp時(shí)，則兩者之間有9個(gè)片段完全相同，并且這些序列集中分布于嬰兒利什曼原蟲36條染色體的29、30號(hào)染色體上。
　　結(jié)論:人Ⅱ A型磷脂酶cDNA片段與嬰兒利什曼原蟲DNA片段之間具有一致性，可能與基因由原蟲向人的橫向傳遞有關(guān)。
　　第二節(jié)ⅡA型磷脂酶A2氨基酸替換與分子進(jìn)化的關(guān)系
　　實(shí)驗(yàn)一靈長(zhǎng)生物抗菌蛋白ⅡA型磷脂酶A2氨基酸取代與分子進(jìn)化的關(guān)系
　　目的:了解靈長(zhǎng)生物的抗菌蛋白ⅡA

12、型磷脂酶A2氨基酸取代的特點(diǎn)及其與分子進(jìn)化的關(guān)系。
　　方法:對(duì)人、猩猩和猴3種哺乳類靈長(zhǎng)生物的ⅡA型磷脂酶A2的氨基酸順序進(jìn)行兩兩比較，并與ⅠB型磷脂酶A2的相對(duì)照，分析它們之間相互取代的位點(diǎn)、頻率和性質(zhì)（極性、非極性;酸性、中性、堿性），利用軟件Cn3D4.1構(gòu)建其蛋白分子的三維晶體結(jié)構(gòu)，了解靈長(zhǎng)類（人、猩猩、猴）ⅡA型磷脂酶A2晶體結(jié)構(gòu)中發(fā)生氨基酸取代（堿基非同義取代）的位置和區(qū)域，總結(jié)出它們的變化規(guī)律，并與殺菌功能相聯(lián)系。

13、
　　結(jié)果:(1)人和猩猩、人和猴、猩猩和猴之間ⅡA型磷脂酶A2蛋白分子分別有4、12、12個(gè)氨基酸殘基發(fā)生取代，且主要發(fā)生在帶電荷的氨基酸;而在發(fā)生的氨基酸取代中，又以帶正電荷的氨基酸（堿性氨基酸）為主;(2)氨基酸取代主要集中在有限的4個(gè)區(qū)域，且為功能重要的區(qū)域。
　　結(jié)論:哺乳類靈長(zhǎng)生物ⅡA型磷脂酶A2的蛋白質(zhì)分子進(jìn)化較快，這可能是它能夠具有殺菌活性的原因。
　　第三節(jié)人ⅡA型磷脂酶A2衍生多肽的抗菌作用研究

14、r>　　實(shí)驗(yàn)一衍生自人ⅡA型磷脂酶A2C末端的多肽殺菌活性的研究
　　目的:觀察衍生自人ⅡA型磷脂酶A2(phospholipase A2，Ⅱ A型PLA2)碳末端(C-terminal)26個(gè)氨基酸殘基的多肽對(duì)不同細(xì)菌在體外的殺菌效應(yīng)，并探討其殺菌作用機(jī)制。
　　方法:根據(jù)人ⅡA型PLA2C末端26個(gè)氨基酸殘基的順序，合成為肽P26。采用瓊脂鋪板計(jì)數(shù)法，將不同濃度的多肽分別與6種細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌、枯草桿菌、大

15、腸桿菌、變形桿菌和綠膿桿菌）在37℃孵育2h，然后鋪板并置于37℃恒溫箱培養(yǎng)18～24h，記錄每一瓊脂板上的菌落生成數(shù)(CFU)，計(jì)算出多肽作用后對(duì)細(xì)菌的殺滅百分率。
　　結(jié)果:肽P26對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、炭疽桿菌等革蘭陽(yáng)性(G+)菌的殺菌作用較強(qiáng);對(duì)大腸桿菌、變形桿菌和綠膿桿菌等革蘭陰性（G-）菌的殺菌作用較弱。
　　結(jié)論:衍生自人ⅡA型PLA2C末端26個(gè)氨基酸殘基的多肽有殺菌作用，推測(cè)其具有和Ⅱ A型PLA2及

16、其他抗菌多肽相似的殺菌機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)二衍生自人ⅡA型磷脂酶A2C末端的多肽P26修飾和改造的研究
　　目的:研究人ⅡA型磷脂酶A2(phospholipase A2，ⅡA型PLA2)C末端衍生多肽P26經(jīng)修飾和改造后對(duì)不同細(xì)菌的殺菌效應(yīng)，分析其作用差異及機(jī)制。
　　方法:以人ⅡA型PLA2氨基酸順序C末端26個(gè)氨基酸殘基為模板，合成線性多肽P26，然后對(duì)此線性多肽分別進(jìn)行修飾和改造，一是將其環(huán)化得到環(huán)狀多肽，二是將其

17、中的4個(gè)堿性氨基酸殘基分別替換為非極性疏水性氨基酸和極性中性氨基酸得到一條新的重組多肽。采用瓊脂鋪板計(jì)數(shù)法，將不同濃度的三種多肽分別與6種細(xì)菌（G+菌的枯草桿菌、炭疽桿菌和金黃色葡萄球菌;G-菌的大腸桿菌、變形桿菌和綠膿桿菌）在37℃孵育2h，然后鋪板并置于37℃恒溫箱培養(yǎng)18～24h，記錄每一瓊脂板上的菌落數(shù)(CFU)，并計(jì)算多肽作用后的殺菌率。
　　結(jié)果:直鏈肽和環(huán)肽P26對(duì)G+菌（包括金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、炭疽桿菌）有較