胃癌相關(guān)基因FBG2、BTG2及S100A6功能意義的研究.pdf

1、研究背景：胃癌是危害人類健康的重大疾病，在我國長期以來調(diào)整發(fā)病率及死亡率一直居于首位，近年來雖然胃鏡檢查得到普及，國人的生活水平也大大提高，但胃癌的發(fā)病率并未見顯著下降。隨著生命科學的發(fā)展人類對胃癌的認識已進入分子水平，發(fā)現(xiàn)并證實了許多與胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因，在一定程度上提升了對于疾病的認識。我室也已開展胃癌的分子生物學研究多年，取得了可觀的研究成果。其中楊少波博士等使用cDNA芯片技術(shù)篩選了胃癌組織與癌周正常組織的差異表達基因，得

2、到了多個顯著差異表達的基因，其中大部分基因功能研究的較清楚，多為細胞代謝相關(guān)基因。但胃癌組織中表達顯著上調(diào)的FBG2、S100A6基因和顯著下調(diào)的BTG2基因國內(nèi)外研究的較少且結(jié)論有矛盾之處，究竟這些基因是確有抑癌或促癌作用或僅為細胞的一種反應性表達改變尚無法闡明。本項研究將以實驗室研究為基礎(chǔ)，緊緊圍繞闡明FBG2、BTG2及S100A6在胃癌中的功能意義展開工作。 目的；①闡明FBG2、BTG2、S100A6基因在MKN45及

3、SGC7901等胃癌細胞系及HFE145正常胃粘膜上皮細胞系的表達情況。②以適合的胃癌細胞系為基礎(chǔ)，通過分子克隆的方法建立FBG2、BTG2、S100A6基因的高表達細胞并對其進行細胞功能學研究初步闡明相關(guān)基因的功能意義。③以適合的胃癌細胞系為基礎(chǔ)，抑制相應基因的表達，建立目的基因低表達細胞系并對其進行細胞功能學研究，進一步闡明相關(guān)基因的功能意義。 方法；①本研究對我實驗室保存的MKN45、SGC7901胃癌細胞系及HFE145

4、正常胃粘膜上皮細胞系行免疫細胞化學法及RT-PCR法檢測，明確FBG2、BTG2、S100A6基因在三株細胞中的表達情況。②設計合成特異性引物通過RT-PCR法從人胃癌組織或正常胃上皮組織中獲得目的基因的cDNA片段，以真核表達載體PCDNA3.1為基礎(chǔ)，通過插入連接反應構(gòu)建出相關(guān)基因的真核表達載體。③設計合成多對特異性相關(guān)基因RNA干擾(RNAi)片段shRNA對應的DNA片段，退火形成雙鏈并通過連接反應插入RNA干擾載體IMGS00

5、中構(gòu)建出相關(guān)基因的RNA干擾載體同時設置點突變對照。④以脂質(zhì)體介導的方法將構(gòu)建好的目的基因真核表達載體及RNAi載體轉(zhuǎn)染相應的細胞系，再通過G418壓力篩選法獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系。⑤選用細胞生長曲線法、平板克隆形成實驗法、流式細胞儀檢測細胞周期及調(diào)亡法、PCNA染色法及細胞遷徙實驗法等方法檢測各穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系功能，初步闡明目的基因在胃癌細胞中的功能意義。 結(jié)果；①通過免疫細胞化學法及RT-PCR法檢測并驗證了FBG2、BTG2、

6、S100A6基因在MKN45細胞中均不表達，F(xiàn)BG2、BTG2基因在SGC7901和HFE145細胞中不表達，S100A6基因在SGC7901細胞中高表達，在HFE145中不表達。②成功構(gòu)建了相關(guān)基因的真核表達載體及S100A6基因的RNAi載體并經(jīng)DNA測序驗證。③FBG2、BTG2基因真核表達載體通過脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染MKN45細胞，S100A6基因的RNAi載體通過脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染SGC7901細胞，后經(jīng)G418壓力篩選法獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)

7、染的細胞系，經(jīng)過RT-PCR法、免疫細胞化學法及Western-bloting法證實。同時免疫細胞化學法證實FBG2、BTG2基因表達產(chǎn)物主要定位分布于細胞漿，而S100A6基因表達產(chǎn)物主要定位分布于細胞漿和細胞膜。穩(wěn)定的S100A6基因的RNAi細胞系也經(jīng)過RT-PCR法、免疫細胞化學法及Western-bloting法證實，mRNA抑制率可達75％左右，蛋白產(chǎn)物的抑制率達85％左右。④細胞功能研究中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FBG2基因的MKN45細

8、胞生長曲線明顯變陡，各時間點細胞計數(shù)顯著高于對照組(P＜0.05)；平板克隆形成率顯著高于對照組(P＜0.05)；細胞周期檢測FBG2轉(zhuǎn)染組G2-M期比例顯著高于兩對照組(P＜0.05)，而S期比例顯著低于對照組(P＜0.05)。細胞凋亡檢測顯示FBG2轉(zhuǎn)染組凋亡比例與對照組相比無顯著差異；細胞遷徙實驗結(jié)果提示FBG2轉(zhuǎn)染組穿膜率與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。⑤穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BTG2基因的MKN45細胞生長曲線明顯變平緩，各時間點細

9、胞計數(shù)顯著低于照組(P＜0.05)；平板克隆形成率顯著低于對照組(P＜0.05)；細胞周期檢測轉(zhuǎn)染組G0-G1期比例顯著高于兩對照組(P＜0.05)，而G2-M及S期比例顯著低于對照組(P＜0.05)。細胞凋亡檢測顯示轉(zhuǎn)染組凋亡顯著高于對照組(P＜0.05)；細胞遷徙實驗結(jié)果提示轉(zhuǎn)染組穿膜率顯著低于對照組(P＜0.05)。⑥穩(wěn)定轉(zhuǎn)染S100A6基因的MKN45細胞生長曲線較對照組變化不明顯，各時間點細胞計數(shù)較對照組差異不顯著(P＞0.0

10、5)而S100A6RNA干擾細胞系生長曲線較對照組明顯平緩，各時間點細胞計數(shù)顯著低于對照組(P＜0.05)；S100A6轉(zhuǎn)染組平板克隆形成率顯著高于對照組而S100A6RNA干擾組克隆形成率顯著低于對照組(P＜0.05)；細胞周期檢測轉(zhuǎn)染組G2-M比例顯著高于對照組，同時S期比例則顯著低于其它兩組(P＜0.05)。S100A6RNA干擾組G0-G1期比例顯著高于對照組，而G2-M及S期比例顯著低于對照組(P＜0.05)。細胞凋亡檢測顯示

11、S100A6轉(zhuǎn)染組凋亡顯著低于對照組而S100A6RNA干擾組凋亡顯著高于對照組(P＜0.05)；細胞遷徙實驗結(jié)果提示轉(zhuǎn)染組穿膜率高于對照組但統(tǒng)計學不顯著(P＞0.05)而S100A6RNA干擾組穿膜率顯著低于對照組(P＜0.05)；PCNA染色法顯示S100A6RNA干擾組細胞陽性率顯著低于對照組(P＜0.05〉。 結(jié)論；綜合以往文獻報道和本研究的結(jié)果，可初步得出以下結(jié)論①FBG2基因在一定程度上可促進細胞生長及有絲分裂，對維