臘梅脂轉移蛋白基因克隆與功能的初步分析.pdf

1、非特異脂轉移蛋白是病程相關的蛋白。被定位在細胞膜上，在體外可以轉運磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇和磷脂酰絲氨酸?？咕鷮嶒灡砻骶哂幸种普婢⒓毦L的能力，同時可能具有抗蟲害的潛力，大量的研究還表明非特異脂轉移蛋白還參與蠟質形成等。因此研究非特異脂轉移蛋白基因有重要的意義。非特異脂轉移蛋白已從多種植物中分離得到，并通過生物技術克隆了大量的非特異脂轉移蛋白的基因。從本實驗室構建的蠟梅花cDNA文庫中，利用EST技術從蠟梅中第一次克隆了兩個非特異脂轉

2、移蛋白基因。通過生物信息學手段，對基因序列進行了分析和功能預測。為了進一步驗證其可能的功能，構建了兩個植物表達載體，通過煙草的轉化獲得了一批轉基岡植株，并對轉基因植株進行了初步分析，主要研究及結果如下： 1、克隆子的獲得在文庫中隨機挑選克隆，提取質粒DNA，以文庫克隆予質粒為模板，利用EST序列DW222703設計特異引物擴增出預計大小(388bp)的特異片段；利用EST序列DW223106設計特異引物擴增出預計大小(446bp

3、)的特異片段，以文庫克隆載體pTriplEx2引物對DW222703擴增出約613bp，對DW223106擴增出653bp的特異片段，經生物信息學分析、網上比對均顯示，從文庫中獲得的CH0092的克隆子代表的基因為EST序列DW222703對應的全長cDNA。從文庫中獲得的CH001477的克隆子代表的基因為EST序列DW223106對應的全長cDNA。 2．序列分析 對兩個目標基因進行了序列分析，兩個基因分別由613和

4、653個核苷酸組成，分別包含一個360和一個351個核苷酸的ORF，分別編碼蛋白長119和116個氨基酸。兩個基因編碼的蛋白理論分子量分別為12.1kD和11.7kD，預測等電點分別為8.57和9.05。 3．表達載體的構建兩個nsLTPs基因均在克隆載體pTriplEx2上，將菌液活化并用X-balI和SmalI雙酶切，最后連入表達載體PC2301上，酶切驗證構建成功PC2301-nsLTP表達載體。 4．目的基因的轉

5、化和植株再生采用葉盤法，通過農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導分別將nsLTP92和nsLTP1477兩個脂轉移蛋白基因分別導入了煙草，各獲得10多株轉基因煙草。 5．轉基因煙草的分子生物學鑒定首先對篩選到的抗性植株進行GUS組織化學檢測，初步表明基因轉入并整合進煙草植株基因組中。然后對GUS染色呈陽性植株再進行PCR檢測。結果表明GUS陽性株系均出現(xiàn)一條與陽性對照相同的特異帶，而非轉化植株則未得劍

6、該特異帶。 6．轉基因植株的抗蚜蟲實驗對轉基岡nsLTP92和nsLTP1477植株的陽性株進行了蚜蟲的抗性統(tǒng)計，方差分析表明當p=0.05時，編號為nsLTP92-1，nsLTP92-3,nsLTP92-4,nsLTP92-5的轉基因植株蚜蟲抗性分析與對照株有差異，而其他轉基因植株與對照株均籌異不顯著，初步說明蠟梅基因nsLTP92可能具備抑制蚜蟲的作用，而基因nsLTP1477則不具備抑制蚜蟲的功能7．轉基因植株的田問觀測對轉基岡n