施普善對慢性低氧高二氧化碳大鼠模型認(rèn)知功能影響及對CREB蛋白、NMDA2B亞單位的影響.pdf

1、目的： 復(fù)制慢性低氧(O2)高二氧化碳(CO2)肺動脈高壓大鼠模型。(1)觀察慢性低O2高CO2對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響；(2)觀察施普善干預(yù)對慢性低O2高CO2大鼠模型空間學(xué)習(xí)記憶的影響；(3)觀察施普善對慢性低O2高CO2大鼠模型海馬區(qū)、皮層區(qū)環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)和N-甲基-D-門冬氨酸受體(NMDA2B亞單位)表達(dá)的影響；(4)初步探討施普善對慢性低O2高CO2誘導(dǎo)的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶變化的可能機(jī)制。

2、 方法： Ⅰ.將44只SPF級雄性SD大鼠，體重280g-310g，6-8月齡，經(jīng)八臂迷宮訓(xùn)練后淘汰12只。將入選的32只大鼠遵循隨機(jī)原則分為四組：(1)空白對照組8只(NC組，n=8)；(2)慢性低O2高CO2+鹽水組8只(HHS組，n=8)；(3)慢性低O2高CO2+施普善(1ml/kg)組8只(HHC1組，n=8)；(4)慢性低O2高CO2+施普善(2.5ml/kg)組8只(HHC2組，n=8)。將八臂迷宮訓(xùn)練成功的HH

3、S組、HHC1組和HHC2組大鼠置于常壓低O2高CO2艙內(nèi)4W，通過氮氣(N2)調(diào)節(jié)艙內(nèi)O2濃度維持在9％-11％，按設(shè)定劑輸入CO2使其艙內(nèi)濃度為5％-6％，每天8h，每周6d。HHC1組和HHC2組于進(jìn)艙前半小時按設(shè)定劑量給予腹腔注射施普善。NC組大鼠除吸入空氣外，其它飼養(yǎng)條件均相同。Ⅱ.飼養(yǎng)至4W后，各組大鼠隨機(jī)先后進(jìn)行八臂迷宮行為學(xué)評測實驗及Morris水迷宮實驗，在進(jìn)行Morris水迷宮測試期間HHS組、HHC1及HHC2組大

4、鼠每日維持低O2高CO2環(huán)境2h。Ⅲ.行為學(xué)測試結(jié)束后取NC組、HHS組、HHC1及HHC2組大鼠戊巴比妥鈉(35mg/kg)腹腔注射麻醉后，采用頸靜脈插管右心導(dǎo)管法檢測平均肺動脈壓(mPAP)，分別稱取右心室(RV)和左心室加室間隔(LV+S)的重量，以RV/(LV+S)重量比作為評價右心室肥大指標(biāo)。Ⅳ.處死大鼠斷頭取半腦組織石蠟包埋后切片，行HE染色及免疫組化法檢測大鼠海馬及皮層區(qū)NMDA2B亞單位的表達(dá)水平，觀察海馬及皮層神經(jīng)原改

5、變。冰上分離剩余半腦海馬和皮層，Western-blotting法測定上述區(qū)域CREB蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果： (1)右心導(dǎo)管法檢測結(jié)果顯示：mPAP測得，HHS組(12.96 mmHg±0.76mmHg)、HHC1組(12.88mmHg±0.18mmHg)及HHC2組(13.80 mmHg±0.67 mmHg)mPAP水平均明顯高于NC組(9.07 mmHg±1.35mmHg)，以上三組分別與NC組比較均有顯著性差異(

6、p均<0.05)；RV/(LV+S)％測得HHS組(35.25±1.67)％、HHC1組(34.59±3.04)％及HHC2組(33.16±4.60)％大鼠RV/(LV+S)％均明顯高于NC組(26.60±3.47)％，以上三組分別與NC組比較均有顯著性差異(p均<0.05)，但三組間無顯著性差異；這些指標(biāo)說明COPD造模成功，且施普善干預(yù)不影響COPD模型的肺動脈壓和心室重量比。 (2)八臂迷宮實驗結(jié)果顯示，在八臂迷宮實驗中，

7、與NC組相比，HHS組的工作記憶錯誤(WME)為(1.31±1.19)次，明顯高于正常對照組(0.56±0.50)次(p<0.05)，而HHC1組和HHC2組工作記憶錯誤(WME)次數(shù)與慢性低O2高CO2模型組相比明顯減少(p<0.05)。在Morris水迷宮實驗中，定位航行測試部分：HHS組第3、4、5d的逃避潛伏期都較NC組明顯延長(p<0.05)，施普善干預(yù)組與HHS組相比逃避潛伏期均縮短，從第3天開始有顯著性差異，至第五天均有顯

8、著性差異(p<0.05)，在空間搜索測試部分，慢性低O2高CO2組的平臺穿越次數(shù)明顯少于NC組及施普善干預(yù)組。 (3)形態(tài)學(xué)變化：NC組海馬各區(qū)椎體細(xì)胞排列整齊，邊界清楚，核膜邊界清晰，核深染、清晰。HHS組細(xì)胞輪廓消失，大多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)胞漿固縮，核固縮碎裂。各施普善干預(yù)組50％細(xì)胞邊界尚清，核形狀規(guī)則，核邊界尚清。 (4)免疫組化法檢測顯示，NC組海馬內(nèi)NMDA2B亞單位表達(dá)呈強陽性，與NC組比較，HHS組大鼠在CA1區(qū)

9、的表達(dá)明顯降低(0.2250±0.0197 vs0.1443±0.1221，p<0.01)。與NC組比較，HHS組大鼠在CA3區(qū)的表達(dá)明顯降低(0.2166±0.0103vs0.1303±0.0072)(p<0.01)，而施普善干預(yù)組能夠增加NMDA2B受體的表達(dá)，尤其是HHC2組的CA1區(qū)CA3區(qū)較HHS組明顯增加(p<0.01)。 (5)Western blotting法檢測顯示，慢性低O2高CO2大鼠皮層區(qū)、海馬區(qū)環(huán)磷酸腺

10、苷反應(yīng)單元結(jié)合蛋白表達(dá)水平減少，施普善干預(yù)可上調(diào)環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元結(jié)合蛋白水平。 結(jié)論： (1)慢性低O2高CO2可促使大鼠mPAP、RV/(LV+S)增高，提示COPD肺動脈高壓大鼠模型的復(fù)制成功。(2)慢性低O2高CO2肺動脈高壓大鼠可產(chǎn)生空間學(xué)習(xí)記憶障礙。(3)慢性低O2高CO2肺動脈高壓大鼠海馬CA1、CA3區(qū)及前額葉CREB蛋白和NR2B的表達(dá)水平明顯減少。(4)慢性低O2高CO2肺動脈高壓大鼠工作記憶和參考記憶