乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥株變異率快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用研究.pdf

1、全世界有3.5億乙肝病毒感染者。乙肝病毒(HBV)是導(dǎo)致肝硬化和肝癌的重要因素，60％~-80％的肝癌患者是乙肝病人。隨著對(duì)乙肝病毒治療的深入研究，各種抗病毒藥物應(yīng)運(yùn)而生。拉米夫定是有效抑制乙肝病毒復(fù)制的核苷類(lèi)似物之一。但是，長(zhǎng)時(shí)間用藥會(huì)導(dǎo)致乙肝病毒出現(xiàn)YMDD區(qū)段發(fā)生變異，即HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的保守序列YMDD中M(蛋氨酸)被V(纈氨酸)或I(異亮氨酸)所取代，變異后成為YVDD(rtM204V)或YIDD(rtM204I)，導(dǎo)致HBV對(duì)

2、拉米夫定產(chǎn)生耐藥，使患者體內(nèi)病毒復(fù)制反彈。 本研究通過(guò)設(shè)計(jì)變異位點(diǎn)的選擇性引物及共用探針，利用熒光定量PCR技術(shù)，建立了一種快速、有效的乙肝病毒YMDD變異率的檢測(cè)方法。突變毒株在病毒群體中的百分比可以根據(jù)突變株和對(duì)照的Ct值差異進(jìn)行計(jì)算。包含耐藥突變的質(zhì)粒經(jīng)過(guò)系列稀釋、混合后進(jìn)行檢測(cè)，以及對(duì)未經(jīng)拉米夫定治療的98例慢性乙肝患者和145例拉米夫定治療的慢性乙肝患者進(jìn)行耐藥突變檢測(cè)，與測(cè)序方法進(jìn)行對(duì)照，對(duì)結(jié)果不符的標(biāo)本再進(jìn)行亞克隆

3、測(cè)序驗(yàn)證。并用該方法對(duì)268例經(jīng)拉米夫定治療的不同時(shí)間患者進(jìn)行病毒變異率檢測(cè)。對(duì)98例經(jīng)拉米夫定治療和64例經(jīng)拉米夫定與干擾素a序貫治療的e抗原陰性患者進(jìn)行病毒變異率檢測(cè)，驗(yàn)證序貫治療的效果及其對(duì)拉米夫定變異的抑制作用。同時(shí)，對(duì)患者體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞活性及T淋巴細(xì)胞亞群情況、肝組織治療前后病理學(xué)變化等進(jìn)行了進(jìn)一步分析。 該方法可以在106～109拷貝/毫升HBV的血清標(biāo)本中檢測(cè)到0.1％的突變毒株。145例拉米夫定治療的慢性乙肝患

4、者中，檢測(cè)到42例耐藥突變株，突變比例為5～10096。6例與測(cè)序結(jié)果不符的標(biāo)本突變比例為5～20％，低于測(cè)序方法的檢測(cè)下限，與亞克隆測(cè)序的結(jié)果相符。98例未經(jīng)拉米夫定治療的慢性乙肝患者中有5例檢測(cè)到耐藥突變，變異比例為10～20％。拉米夫定治療組的拉米夫定耐藥株變異率(22.45％)顯著高于序貫治療組。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究所建立的拉米夫定耐藥株變異檢測(cè)方法快速靈敏，可以用于臨床治療中拉米夫定耐藥變異的監(jiān)測(cè)，為臨床治療方案的選