沙田柚自交和異交花柱miRNA測序及miRNA的差異表達分析.pdf

1、沙田柚屬蕓香科柑橘屬果樹，為配子體高度自交不親和植物，其自交不親和的分子機理目前尚未見報道。miRNA是一類序列長度為20-24nt的非蛋白質(zhì)編碼的內(nèi)源小分子RNA，在植物的生長發(fā)育和逆境脅迫反應(yīng)等過程起著重要作用。因此，尋找與沙田柚自交不親和相關(guān)的miRNA，闡述由miRNA介導(dǎo)的自交不親和反應(yīng)的分子機制尤為重要。
　　本研究以沙田柚未授粉花柱(SC)、自交1、2、3天(ZJ1、ZJ2、ZJ3)以及異交1、2、3天花柱(YJ1、

2、YJ2、YJ3)為實驗材料，構(gòu)建小RNA測序文庫。利用HiSeq深度測序?qū)λ械腟mall RNA進行測序。然后對差異表達miRNA進行分類注釋和靶基因預(yù)測，并對靶基因進行GO功能注釋以及KEGG pathway注釋，探討miRNA在沙田柚自交不親和中的作用。主要結(jié)果如下:
　　1、采用高通量測序技術(shù)對沙田柚7個樣品的小RNA文庫進行測序，各個樣品獲得的total-reads分別為:SC為13326242、YJ1為23674636

3、、YJ2為14465682、YJ3為24805180、ZJ1為21113205、ZJ2為19050972、ZJ3為22881662。去除低質(zhì)量序列、接頭序列、小于18nt的序列后，獲得的clean-reads分別為:SC為11523295、YJ1為23046850、YJ2為12556786、YJ3為23949192、ZJ1為20472150、ZJ2為18567950、ZJ3為22197840。將獲得的clean-reads比對到基因組，

4、各樣品比對到基因組的sRNA的數(shù)目分別為:SC為7284921、YJ1為16759796、YJ2為8594610、YJ3為17855172、ZJ1為15341949、ZJ2為13545677、ZJ3為16132232。
　　2、基于miRNA相似性序列和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果表明:7個樣品中鑒定出已知的miRNA屬于28個家族，包括一個未定義家族。7個樣品中，未授粉花柱中已知miRNA的個數(shù)為118，新miRNA為411個。異交1、2

5、、3天花柱中的已知miRNA的個數(shù)分別為232、122和219個，新miRNA分別為1184、476和836個。自交1、2、3花柱中已知miRNA的個數(shù)分別為178、179和186個，而新miRNA則分別為640、739和801個。各樣品中新miRNA數(shù)量要大于已知的miRNA數(shù)量。
　　3、異交/自交差異表達的miRNA中，miR390a-5p調(diào)控有刺激花粉管生長作用的生長素應(yīng)答反應(yīng)，可能在花粉管生長中發(fā)揮作用;miR172a-

6、5p靶向泛素化途徑中的SCF復(fù)合體，該靶基因參與的泛素蛋白酶體途徑通過與miR5059靶向的AUX/IAA與植物激素信號傳導(dǎo)途徑相聯(lián)系，且兩個miRNA表達模式基本一致，說明其可能通過調(diào)控兩條代謝途徑參與自交不親和。在自交和異交樣品中持續(xù)上調(diào)或下調(diào)的miRNA中，miR171f在異交樣品中持續(xù)下調(diào)，而miR393-3p在異交樣品中持續(xù)上調(diào)，這兩個miRNA主要參與植物的脅迫應(yīng)答反應(yīng)，已經(jīng)證明授粉與壓力脅迫應(yīng)答顯示有重疊。miR6197-

7、5p、miR414靶基因功能注釋為在花粉管生長過程發(fā)揮作用的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，并在YJ/ZJ中差異表達;說明以上的miRNA可能在自交不親和反應(yīng)中發(fā)揮一定作用。
　　4、novel_mir_691和novel_ mir_1021靶向生長素轉(zhuǎn)錄因子;novel_mir_17靶基因注釋到cullin-like protein;靶基因注釋為14-3-3 protein（參與多種植物激素信號通路）的novel_ mir_2854和nove

8、l_mir_1770靶向細胞膜成分的磷脂酰肌醇，在YJ/ZJ中存在差異表達，說明可能參與到了自交不親和反應(yīng)中去。
　　5、在自交花柱中特有并差異表達的miRNA: novel_mir_2344靶基因功能為果膠酯酶抑制劑，miR9470-3p靶基因功能有γ-氨基丁酸(GABA)受體和參與糖酵解途徑，miR9560a-5p靶基因功能為壁相關(guān)受體激酶，miR395靶基因功能為半乳糖代謝和在壁的合成中也發(fā)揮一定作用，miR2118b靶基因

9、功能為熱激蛋白和分子伴侶功能，miR8775靶基因功能包括有泛素調(diào)節(jié)蛋白酶體途徑;miR9560a-5p與novel_ mir_651持續(xù)在自交三天持續(xù)上調(diào)，分別靶向壁受體相關(guān)蛋白激酶和植物激素信號傳導(dǎo)過程受體蛋白，這些miRNA在自交不親和中可能發(fā)揮負調(diào)控作用。novel_mir_2651的靶基因為影響花粉管生長的肌動蛋白結(jié)合蛋白和類黃酮，此外還有影響孢粉素（花粉壁組成成分）的細胞色素P450，但關(guān)于其調(diào)控模式和在沙田柚自交不親和中的