乙型肝炎病毒X蛋白與hDaxx相互作用及對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：應(yīng)用酵母雙雜交法檢測(cè)乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白（HBx）與hDaxx的相互作用，并初步探討其相互作用后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步研究HBx在HBV慢性感染致癌機(jī)制中的作用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： (1)構(gòu)建酵母菌真核表達(dá)載體pGADT7-HBx：根據(jù)已知的HBV X基因序列，采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，并分別引入EcoR I與 Xho I酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增X基因；用EcoRI和

2、Xho I分別雙酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pGADT7，分別純化回收酶切產(chǎn)物，T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定。 (2)構(gòu)建酵母菌真核表達(dá)載體pGBKT7-hDaxx：用EcoRI和SalI分別雙酶切質(zhì)粒pGBDU-C1/hDaxx和pGBKT7，分別純化回收酶切產(chǎn)物，T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選到陽性克隆后，對(duì)重組質(zhì)粒行酶切鑒定。 (3)酵母雙雜交檢測(cè)HB

3、x與hDaxx的相互作用：將酵母菌真核表達(dá)載體及酵母菌陰性陽性對(duì)照質(zhì)粒分4組轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，A組為pGADT7和pGBKT7、B組為pGADT7-HBx和pGBKT7-hDaxx、C組為pGADT7-T和pGBKT7-Lam、D組為pGADT7-T和pGBKT7-p53，將轉(zhuǎn)化菌落接種于SD/-Trp-Leu（二缺）固體平板，30℃培養(yǎng)2～4d。將單個(gè)菌落接種于SD/-Trp-Leu-His（三缺）和SD/-Trp-Leu-His

4、-Ade（四缺）平板，30℃培養(yǎng)2～4d。裂解酵母菌，提取蛋白，經(jīng)SDS-PAGE、Western blot檢測(cè)hDaxx和HBx在酵母中的表達(dá)。 (4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將HBV X基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞(即HepG2X)，再瞬時(shí)轉(zhuǎn)染15μg、30μg和 45μg pcDAN3.1-hDaxx，以pcDNA3.1(＋)轉(zhuǎn)染HepG2X組和HepG2X組分別作為對(duì)照。用10mmol/L的5-氟尿嘧啶(5-FU) 處

5、理36h后分別收集各組細(xì)胞，經(jīng)75％的乙醇4℃固定過夜，PI染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)分析。 結(jié)果： (1)PCR擴(kuò)增HBV X基因片段（465bp），將X基因克隆至pGADT7載體上，經(jīng)雙酶切及測(cè)序分析，所克隆的目的片段與已知的X基因序列及GeneBank上公布的HBV X基因（Pubmed NC_U95551）序列完全一致。 (2)將p

6、GBDU-C1/hDaxx上的hDaxx基因片段亞克隆至pGBKT7載體上，經(jīng)雙酶切分析，得約2.2kb大小的hDaxx基因片段，與預(yù)期值大小一致。 (3)分4組轉(zhuǎn)化的酵母菌AH109在二缺陷平板上均可長(zhǎng)出白色菌落，但僅有B、D兩組菌可以在三缺和四缺平板上生長(zhǎng)，選取B組四缺陷平板上單個(gè)菌落，提取酵母蛋白， Western blot檢測(cè)到hDaxx和HBx在同一株酵母菌株中均有表達(dá)。 (4)將X基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入HepG2

7、細(xì)胞，Western blot檢測(cè)到HBx在HepG2X細(xì)胞中的表達(dá)。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，HepG2細(xì)胞用5-FU處理后凋亡率明顯高于未經(jīng)5-FU處理的細(xì)胞組，結(jié)果具有顯著性差異（P<0.01）；HepG2X組細(xì)胞凋亡率明顯低于空細(xì)胞組，結(jié)果具有顯著性差異（P<0.01）；而轉(zhuǎn)染pcDAN3.1-hDaxx后，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步降低，但與轉(zhuǎn)染入的pcDAN3.1-hDaxx量沒有劑量依賴關(guān)系。 結(jié)論： (1)成功地構(gòu)建了p