表沒食子兒茶毒沒食子酸酯(EGCG)改善脂毒性誘導的大鼠外周胰島素抵抗及胰島β細胞功能障礙的實驗研究.pdf

1、前言：胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷是2型糖尿病發(fā)生公認的病理生理基礎,但其具體機制尚未完全明了。目前2型糖尿病與肥胖緊密相關已經成為一種共識。肥胖者由于體內脂肪組織的過度積聚,導致釋放過多的游離脂肪酸(Free Fatty AcidFFA)。眾多證據表明,脂代謝紊亂在2型糖尿病發(fā)病中居于重要地位,FFA升高是2型糖尿病其發(fā)病的獨立危險因素,日益受到學術界的廣泛關注。近些年的研究表明,在2型糖尿病的產生和發(fā)展過程中,氧化應激不僅關系到胰島素

2、抵抗(即影響胰島素的作用靶點,如肝臟、脂肪和肌肉組織),而且直接影響胰島B細胞的功能,在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過程中起了重要作用。抗氧化劑可減少由基產生或直接滅活機體產生的自由基,并增強機體的抗氧化能力,從而阻止或延緩糖尿病的發(fā)生、發(fā)展。因此,深入研究氧化應激與糖尿病之間的相互關系,以及各種抗氧化劑的作用機制及效果,不但有助于了解糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機制,而且將為糖尿病及其并發(fā)癥的治療提供了一個新的策略。
　　 近幾年,茶葉的提取

3、物茶多酚因其安全無污染及強大的抗氧化作用日益受到大家的青睞。在茶多酚中,各組成份中以黃烷醇類為主,黃烷醇類又以兒茶素(catechins)類物質為主,包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)和表兒茶素沒食子酸酯(ECG)等,其中EGCG的含量最高,約占茶多酚總量的50％-70％。目前國內外一些在細胞、動物模型及人群流行病學方面的研究認為EGCG可以改善胰島素抵抗及葡萄糖耐量,但其具體機制尚未清楚

4、。而對于EGCG對胰島β細胞功能影響方面的研究,目前的結論尚存在爭議。因此,本研究建立急性的游離脂肪酸升高引起胰島素抵抗的動物模型,以排除慢性高脂的代償性反應,應用國內外公認的評價胰島素抵抗的金標準——高胰島素正血糖鉗夾試驗評價靜脈應用不同劑量EGCG對胰島素抵抗的改善情況,并探討其機制。同時,初步探討其對高脂條件下Wistar雄性大鼠的胰島β細胞功能的影響及其可能機制。
　　 方法：
　　 (一)大鼠麻醉狀態(tài)下行頸動靜

5、脈置管術,術后恢復3天后清醒狀態(tài)下分別輸注生理鹽水、脂肪乳以及脂肪乳加不同劑量EGCG;
　　 (二)清醒狀態(tài)下行高胰島素正血糖鉗夾試驗評價大鼠胰島素敏感性;
　　 (三)采用葡萄糖氧化酶法測定血糖,放射免疫法測定胰島素和c肽;采用比色法測定血漿游離脂肪酸(FFA)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性,ELISA方法測定血漿中8-異前列腺素水平;
　　 (四)用Weste

6、rn-Blot方法檢測肌肉,脂肪組織中AMP-activatedproteinkinase(AMPK),phospho-AMPK(Thr172)及胰島素信號轉導過程中相關信號分子IRS-1,phospho-IRS-1(Ser307),Akt,phospho-Akt(Ser473)活性;
　　 (五)免疫組化方法檢測肌肉、脂肪組織GLUT-4;
　　 (六)用兩步法高糖鉗夾試驗評價各組大鼠胰島β細胞功能;
　　 (

7、七)免疫組化方法檢測胰腺組織胰島素的表達;
　　 (八)胰腺組織勻漿MDA、SOD、GPx的檢測;
　　 (九)Tunel方法檢測胰腺組織胰島β細胞凋亡情況;
　　 (十)Western-Blot方法檢測胰腺組織凋亡相關蛋白Bcl-2,Bax的表達。
　　 結果：
　　 (一)在基礎狀態(tài),與生理鹽水輸注組(SAL)比較,脂肪乳輸注組(IH)組FFA增加了1倍(P＜0.01),血糖升高0.16倍(P

8、＜0.05),胰島素和C-肽分別增加了0.71倍、0.59倍(P＜0.05)。EGCG處理組與脂肪乳組相比,FFA水平無明顯變化,血糖水平輕度下降(P＜0.05),胰島素和C肽水平也分別明顯下降(P＜0.05);鉗夾組與鹽水組相比,FFA水平輕度下降(P＜0.01),胰島素水平大幅度升高(P＜0.01),C-肽明顯減少(低于所用試劑盒檢測下限);
　　 (二)在高胰島素正血糖鉗夾試驗中,脂肪乳輸注組(IH)葡萄糖輸注率(GIR)

9、與生理鹽水組(SAL)相比下降了39％(P＜0.05),與脂肪乳輸注組相比,小劑量EGCG干預組(L-EGCG)GIR增加了56％,大劑量EGCG干預組(H-EGCG)GIR增加了72％,單獨EGCG干預組(EGCG)GIR與鹽水組(SAL)相比無明顯變化;
　　 (三)脂肪乳輸注增加了血清中氧化應激指標MDA(P＜0.01)和8-異前列腺素濃度(P＜0.01),減少了抗氧化酶SOD(P＜0.01)和GPx濃度(P＜0.01);

10、與脂肪乳組相比,2個劑量的EGCG干預組MDA(P＜0.05)和8-異前列腺素濃度(P＜0.05)均有所減少,SOD(P＜0.05)和GPx濃度(P＜0.05)都有所升高;
　　 (四)在肌肉組織中,脂肪乳組Thrl72位點磷酸化的AMPK明顯減少(P＜0.05),Ser307位點磷酸化的IRS-1活性增加(P＜0.05),Ser473位點磷酸化的Akt活性下降(P＜0.05),GLUT-4膜轉運減少(P＜0.05),小劑量EG

11、CG干預組(L-EGCG)和大劑量EGCG干預組(H-EGCG)Thr172位點磷酸化的AMPK表達均明顯增多(P＜0.05),Ser307位點磷酸化的IRS-1活性下降(P＜0.05),Ser473位點磷酸化的Akt活性增加(P＜0.05),GLUT-4膜轉運增加(P＜0.05);
　　 (五)在脂肪組織中,脂肪乳組Thr172位點磷酸化的AMPK明顯減少(P＜0.05),Ser307位點磷酸化的IRS-1活性增加(P＜0.0

12、5),Ser473位點磷酸化的Akt活性下降(P＜0.05),GLUT-4膜轉運減少(P＜0.05),大劑量EGCG干預組(H-EGCG)Thr172位點磷酸化的AMPK表達均明顯增多(P＜0.05),Ser307位點磷酸化的IRS-1活性下降(P＜0.05),Ser473位點磷酸化的Akt活性增加(P＜0.05),GLUT-4膜轉運增加(P＜0.05),單獨EGCC干預組與鹽水組相比,各項指標無明顯變化(P＜0.05);
　　

13、 (六)在兩步高糖鉗夾試驗中,脂肪乳輸注組大鼠在高糖刺激下的胰島素分泌曲線變鈍,胰島素變化率下降(P＜0.05),小劑量EGCG干預組(L-EGCG)和大劑量EGCG干預組(H-EGCG)葡萄糖刺激下的胰島素分泌率有不同程度的增加(P＜0.05);
　　 (七)脂肪乳48小時靜脈輸注增加了大鼠胰腺組織胰島細胞的凋亡(P＜0.05),而10mg/kg的EGCG干預組可以減少胰島β細胞的凋亡(P＜0.05);
　　 (八)脂

14、肪乳48小時靜脈輸注減少了胰腺組織抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,增加了促凋亡蛋白Bax的表達,減少了Bcl-2/Bax(P＜0.05),而10mg/kg的EGCG干預組抗凋亡蛋白Bcl-2的表達增加,促凋亡蛋白Bax的表達減少,Bcl-2/Bax增加(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 給Wistar雄性大鼠靜脈輸注脂肪乳48小時使大鼠體內FFA濃度升高了1倍左右,高胰島素正血糖鉗夾試驗中脂肪乳組大鼠葡萄糖輸注率顯著下降

15、,說明脂肪乳輸注誘導了大鼠的胰島素抵抗;
　　 靜脈給予5mg/kg和10 mg/kg EGCG干預明顯改善了大鼠的胰島素抵抗狀態(tài);脂肪乳輸注組大鼠血清中氧化損傷的指標升高,抗氧化酶活性下降。機體出現(xiàn)胰島素抵抗,給予EGCG干預后,氧化損傷的指標下降,抗氧化酶活性升高,胰島素抵抗改善,說明氧化應激參與了脂毒性誘導的胰島素抵抗,而EGCG可以改善脂毒性誘導的胰島素抵抗;
　　 脂肪乳輸注組大鼠脂肪和肌肉組織中Thr172位

16、點磷酸化的AMPK活性下降,給予EGCG干預后Thr172位點磷酸化的AMPK活性恢復,胰島素抵抗恢復,說明EGCG活化了AMPK途徑,并可能參與了胰島素信號傳導過程,改善了胰島素抵抗;
　　 脂肪乳輸注組大鼠脂肪和肌肉組織中經典的胰島素信號傳導通路中Ser307位點磷酸化的IRS-1活性增加,Ser473位點磷酸化的Akt活性下降,GLUT-4膜轉運減少,而在EGCG干預組,這些指標都得到了不同程度的恢復,說明EGCG改善了經