表沒食子兒茶素沒食子酸酯對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細胞功能的影響及分子機制研究.pdf

1、研究背景:
　　 心室重構(gòu)是心臟在多種形式的損傷因素作用下所產(chǎn)生的大小、形狀、室壁厚度和組織結(jié)構(gòu)等一系列變化，是病變修復(fù)和心室整體代償及繼發(fā)的病理生理反應(yīng)過程。在心室重構(gòu)中，多種炎癥細胞因子和神經(jīng)體液因子如血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)和內(nèi)皮素(endothelin，ET)等的作用，使心肌成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CFs）通過分泌多種細胞因子與生長因子、細胞外基質(zhì)(extracell

2、ular matrix，ECM)的合成與降解失衡、增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)化等多種途徑，參與病理性心室重構(gòu)過程。臨床上預(yù)防細胞增殖和心肌纖維化是阻止心室重構(gòu)的關(guān)鍵。AngⅡ刺激CFs還可分泌多種細胞因子，這些因子以旁分泌或自分泌的方式調(diào)控CFs自身和周圍的心肌細胞代謝結(jié)構(gòu)功能而參與心肌重構(gòu)。AngⅡ受體有四種亞型，分別為AT1R、AT2R、AT3R和AT4R，目前認為AngⅡ引起CFs產(chǎn)生的多種生物學(xué)效應(yīng)主要由AT1R介導(dǎo)，臨床上用AT1R受

3、體拮抗劑防治高血壓和心衰已取得較好的近期療效。AT1R又分為兩個亞型，即AT1aR和AT1bR。AT1受體為經(jīng)典的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptors，GPCRs)，因此對G蛋白信號通路的調(diào)控是心肌重構(gòu)潛在的治療靶點。
　　 AT1通過Gq蛋白激活磷脂酶C（Phospholipase C，PLC），水解二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol4，5-bisphosphate，P

4、IP2）產(chǎn)生三磷酸肌醇(1，4，5，-trisphosphate，IP3)和二?；视?diacyl glycerol，DAG)，促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+庫釋放Ca2+，引起胞內(nèi)游離Ca2+濃度瞬間增加，活化蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC)，介導(dǎo)PKC-依賴性酪氨酸激酶途徑，刺激人CFs蛋白質(zhì)合成過程。
　　 受體在受到連續(xù)的刺激后通常會出現(xiàn)脫敏的現(xiàn)象。β-arrestin與G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G-protein-

5、coupled receptor kinases，GRK)聯(lián)合作用，通過介導(dǎo)受體脫敏和內(nèi)吞，對大部分GPCRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有重要的負調(diào)節(jié)作用。β-arrestin有β-arrestin1和2兩個亞型，廣泛的存在于各種細胞中。當(dāng)GPCRs被激活后，β-arrestin轉(zhuǎn)移到細胞膜，結(jié)合到被激動劑占領(lǐng)的受體上，促使這些受體與G蛋白分離，從而導(dǎo)致受體脫敏?；罨摩?arrestin分子釋放出C末端，與胞內(nèi)小泡表面的網(wǎng)格蛋白(clathrin

6、)結(jié)合，介導(dǎo)GPCRs的內(nèi)吞。β-arrestin可以調(diào)節(jié)內(nèi)吞后GPCRs的運輸模式，在GPCRs循環(huán)中起到了特別的作用。近期研究表明，β-arrestin不僅僅是信號的終止子，還是GPCRs介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的支架蛋白，他還可以改變G蛋白介導(dǎo)的第二信使通路激活MAPK。除了調(diào)節(jié)GPCRs的脫敏和信號傳遞，β-arrestin1還可以進入細胞核內(nèi)直接或間接影響一些轉(zhuǎn)錄因子，在基因表達調(diào)控上發(fā)揮更多的功能，β-arrestin介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

7、和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是細胞生物學(xué)的新發(fā)現(xiàn)，也是治療GPCRs功能失調(diào)疾病的新靶點。大鼠心梗后心衰模型的心肌β-arrestin-1 mRNA和蛋白表達均升高，免疫組化檢測提示β-arrestin-1可能是內(nèi)皮功能的主要調(diào)節(jié)因子。腎上腺過表達β-arrestin-1促進心肌梗死后醛固酮水平的升高，從而加速心臟的有害再構(gòu)并降低心室功能。體內(nèi)抑制腎上腺β-arrestin-1基因表達后可顯著減少循環(huán)中醛固酮水平而阻止上述有害變化。AT1R拮抗劑氯沙坦不

8、能降低β-arrestin-1升高的醛固酮水平。對心衰動物模型的研究提示，β1-腎上腺素受體和AT1R介導(dǎo)的β-arrestin依賴的EGFR/ERK信號活化對心臟起到了保護作用。
　　 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)是從綠茶中提取的一種單體成份，它是綠茶主要的活性和水溶性成份，是兒茶素中含量最高的組分，占綠茶毛重的9％-13％，具有潛在的抗炎、抗腫瘤等作用，同時對心臟的保

9、護作用也受到關(guān)注。EGCG被認為介導(dǎo)一氧化氮引起的血管舒張，保護缺血再灌注心臟。同時研究發(fā)現(xiàn)EGCG可以有效地減輕壓力負荷造成的大鼠心臟肥厚和重構(gòu)，阻止心臟肥厚中的心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制心肌成纖維細胞的異常增殖而改善心肌重構(gòu)，組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)EGCG可有效的減輕左心室心肌纖維化程度。因此EGCG可能成為治療患者心肌重構(gòu)的有效藥物。
　　 目前的研究多認為EGCG對于心肌保護主要通過抑制氧化應(yīng)激，而沒有EGCG對心肌成

10、纖維細胞AngⅡ受體AT1R調(diào)節(jié)作用的報道。但在嗎啡引起的身體依賴性研究中發(fā)現(xiàn)，EGCG可以適度降低藍斑中嗎啡升高的cAMP水平，抑制多巴胺受體2(一種GPCRs)信號通路，對嗎啡引起的身體依賴性產(chǎn)生顯著地藥理作用。綜上所述，現(xiàn)有證據(jù)表明EGCG對G蛋白信號通路有確定作用，目前的研究多認為EGCG的通過抑制氧化應(yīng)激發(fā)揮心臟保護作用，但尚不清楚EGCG對心肌成纖維細胞AngⅡ受體AT1R是否具有調(diào)節(jié)作用，同時β-arrestin是GPCR

11、s的重要調(diào)節(jié)分子。因此我們希望了解在心肌成纖維細胞異?；罨^程中，AT1R的調(diào)節(jié)分子β-arrestin發(fā)揮了怎樣的作用？EGCG是否通過調(diào)節(jié)β-arrestin影響AT1R而發(fā)揮抑制心肌成纖維細胞異常增殖的作用？
　　 本實驗擬在體外用AngⅡ活化的新生大鼠心肌成纖維細胞為研究對象，采用小干擾RNA（small interfering RNAs，siRNA）、實時熒光定量RT-PCR(real-timequantitative

12、 reverse transcription PCR, RT-qPCR)和western blot等手段，探討β-arrestin在CFs中的表達和分布變化及其對AT1R信號的調(diào)控作用，以進一步揭示CFs活化和ECM合成的機制，同時觀察EGCG對CFsβ-arrestins表達和AT1R信號的影響，以進一步闡明其抑制心肌成纖維細胞增殖和活化的分子機制。
　　 研究目的:
　　 1.分離培養(yǎng)新生大鼠心肌成纖維細胞，觀察EG

13、CG對正常CFs和血管緊張素Ⅱ異?；罨疌Fs功能的影響。
　　 2.探討EGCG對心肌成纖維細胞β-arrestin-1和β-arrestin-2表達的影響，揭示β-arrestin表達變化與細胞活性之間的相關(guān)性。
　　 3.闡明β-arrestin-1對心肌成纖維細胞AT1R表達、細胞活性、增殖和膠原合成能力的影響及EGCG的作用。
　　 4.揭示EGCG對血管緊張素Ⅱ受體AT1R-Gq-PKC信號通路的影響。

14、
　　 研究方法:
　　 1.新生大鼠心肌成纖維細胞的分離培養(yǎng)和鑒定
　　 取新生1～3天的Sprague-Dawley(SD)大鼠，在超凈工作臺上無菌取出心臟，分離心室肌組織，剪碎，用胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶消化成單細胞懸液，去除非貼壁細胞，貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)。進行細胞爬片，冷丙酮固定后用免疫組化法檢測培養(yǎng)細胞中波形蛋白（成纖維細胞中大量表達）的表達情況，染色陽性證實為心肌成纖維細胞。第2～～4代細胞用于實驗。

15、>　　 2.體外給藥分組
　　 細胞同步化后，用AngⅡ(1×10-7 mol/L)體外作用CFs，設(shè)EGCG(1×10-9，1×10-8，1×10-7，1×10-6，1×10-5 mol/L)五個給藥組，用血管緊張素Ⅱ受體反向激動劑纈沙坦(valsartan，Val)(1×10-6mol/L)作為陽性對照給藥，給藥后培養(yǎng)24小時，并設(shè)正常CFs組。檢測EGCG對正常CFs的影響設(shè)正常細胞組和EGCG（1×10-5 mol/L

16、）給藥組。
　　 3.CFs細胞活力檢測
　　 采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)法檢測CFs的活力。同步化后體外用AngⅡ刺激或給予不同濃度EGCG處理后培養(yǎng)24h，終止培養(yǎng)前6h每孔加入MTT，棄去上清后每孔加入二甲亞砜(Dimethyl sulfoxide，D

17、MSO)，震蕩30s后于酶標(biāo)儀570nm處檢測吸光度值。
　　 4.CFs細胞增殖能力和膠原合成量檢測
　　 采用3H-TdR參入法檢測CFs的增殖能力，3H-羥脯氨酸參入法檢測膠原合成量。細胞同步化后體外用AngⅡ刺激或給予不同濃度EGCG處理后培養(yǎng)24h，終止培養(yǎng)前6h每孔加入3H-TdR或3H-羥脯氨酸，培養(yǎng)結(jié)束用胰酶消化細胞，用多頭細胞收集儀收集細胞至玻璃纖維紙上，烘干后加入閃爍液溶解，以液體閃爍計數(shù)器測定每分鐘

18、的脈沖數(shù)cpm。
　　 5.RT-qPCR檢測
　　 用Trizol法提取CFs總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以GAPDH為參照，通過RT-qPCR技術(shù)檢測β-arrestin-1、AT1aR和AT1bR mRNA水平的表達。
　　 6.Western blot檢測
　　 CFs中加入適量細胞裂解液，反復(fù)凍融破碎細胞，3000×g離心，提取上清即為細胞總蛋白，用Lowry法定量后加入上樣緩沖液，煮沸，進

19、行聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，經(jīng)過分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、二抗、顯色等，分別檢測細胞總β-arrestin-1、β-arrestin-2、AT1R、Gq的表達水平。細胞總蛋白繼續(xù)用37000×g離心，上清為胞漿蛋白，定量后用于檢測細胞漿磷酸化PKC-delta的表達情況;沉淀用細胞裂解液溶解后定量，用于檢測

20、細胞膜β-arrestin-1、ATⅡR和磷酸化PKC-delta(p-PKC-delta)表達水平。采用廣譜鈣粘附素(pan cadherin)鑒定胞漿胞膜蛋白的分離效率。
　　 7.大鼠CFsβ-arrestin-1的siRNA沉默
　　 用β-arrestin-1的siRNA干擾試劑盒干擾大鼠CFs中β-arrestin-1基因表達。設(shè)計3對干擾序列。CFs用不含抗生素的血清培養(yǎng)到70％以上融合，吸棄舊培養(yǎng)液，PB

21、S洗滌，加不含抗生素、含5％胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM。將siRNA/Lipofectamin2000復(fù)合物，加到含有細胞和Opti-MEM培養(yǎng)基的6孔板中。孵育6h后，除去復(fù)合物，更換5％ DMEM，再培養(yǎng)24h、48h、72h。熒光顯微鏡觀察最佳轉(zhuǎn)染時間，提取蛋白，進行Western Blot檢測，確定最佳干擾序列和干擾效率。
　　 8.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 所有數(shù)據(jù)用SPSS17

22、.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)值變量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用小樣本T檢驗，多組間差異顯著性比較采用One-Way ANOVA方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.心肌成纖維細胞的培養(yǎng)情況
　　 用倒置顯微鏡觀察，心肌成纖維細胞生長迅速，2～3天即呈匯合狀態(tài)，細胞排列整齊緊密，有的交叉重疊生長。心肌成纖維細胞呈梭形，胞體較大，胞質(zhì)透明;細胞核較大，呈

23、橢圓形，通常含2～3個核，無自發(fā)性搏動。
　　 2.心肌成纖維細胞的鑒定
　　 用免疫組化法檢測上述方法培養(yǎng)的第2代新生大鼠心臟細胞中波形蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)細胞波形蛋白染色呈強陽性，符合心肌成纖維樣細胞的特征。
　　 3.EGCG對正常大鼠心肌成纖維細胞活力、增殖和膠原合成的影響
　　 EGCG對正常大鼠CFs的細胞活力、增殖和膠原合成能力均無顯著影響(P＞0.05)。說明EGCG對正常CFs沒有抑制作用

24、。
　　 4.EGCG對AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細胞活力、增殖和膠原合成的影響
　　 MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，EGCG1×10-7-1×10-5 mol/L濃度依賴性的抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CFs細胞活力(P＜0.05或P＜0.01)，Val1×10-6 mol/L也具有明顯的抑制作用(P＜0.01);AngⅡ作用24h后，細胞3H-TdR和3H-羥脯氨酸的參入量顯著增多，EGCG1×10-7-1×10-5 mol/L顯著抑制

25、AngⅡ作用下CFs的增殖能力(P＜0.05或P＜0.01)，EGCG1×10-6-1×10-5 mol/L明顯減少活化CFs膠原的產(chǎn)生(P＜0.05或P＜0.01)，Val均可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CFs增殖和膠原合成(P＜0.01)。以上結(jié)果提示，EGCG體外對AngⅡ誘導(dǎo)的CFs異?；罨?、增殖和膠原合成有顯著恢復(fù)作用。
　　 5.EGCG對AngⅡ作用下CFsβ-arrestin-1和β-arrestin-2表達水平的影響與

26、其對細胞活力影響的相關(guān)性分析
　　 AngⅡ作用下，CFs中β-arrestin-1 mRNA的表達水平顯著升高(P＜0.01)，EGCG1×10-6、1×10-5 mol/L顯著恢復(fù)β-arrestin-1 mRNA水平(P＜0.01)。然而，AngⅡ的刺激和EGCG體外給藥均不能影響CFs中β-arrestin-2的蛋白表達水平(P＞0.05)。上述研究結(jié)果證實，β-arrestin-1參與了AngⅡ誘導(dǎo)的CFs活化，而β-

27、arrestin-2作用不明顯，且β-arrestin-1也是EGCG發(fā)揮作用的分子靶點之一。將EGCG對AngⅡ誘導(dǎo)下CFs活力的影響和β-arrestin-1 mRNA水平的影響進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，二者存在顯著地正相關(guān)(R2=0.9304，P=0.0019)。以上結(jié)果提示，EGCG對CFs活力的抑制作用與減少β-arrestin-1基因表達有關(guān)，β-arrestin-1在CFs的異?；罨锌赡芷鸬酱龠M作用。
　　 6.β-a

28、rrestin-1在AngⅡ誘導(dǎo)CFs AT1R表達、細胞活化、增殖和膠原合成中的作用及EGCG的影響
　　 為進一步確定β-arrestin-1在CFs活化中的作用，我們用siRNA沉默CFs中β-arrestin-1的表達，RT-qPCR和western blot法篩選出最佳干擾序列為Sense:5’-AGC CUUCUGUGCUGAGAACTT-3’,Anti-sense:5’-GUUCUCAGCACAGAAGGCUTT-

29、3’，該序列可以減少56.7％的β-arrestin-1基因表達和55％的蛋白表達。與對照序列相比，在沉默了β-arrestin-1基因的CFs中加入AngⅡ培養(yǎng)24h，細胞膜AT1R分布明顯增多(P＜0.05)，對細胞活力、細胞增殖能力和膠原合成能力的影響明顯減小(分別為P＜0.01、P＜0.01和P＜0.05); EGCG1×10-5 mol/L體外給藥可以進一步升高AngⅡ作用下AT1R膜表達(P＜0.05)，抑制細胞的活力和增殖

30、能力(P＜0.05)，但對膠原合成沒有明顯影響(P＞0.05)。以上結(jié)果證明，β-arrestin-1調(diào)節(jié)AT1R內(nèi)吞，是參與AngⅡ介導(dǎo)CFs活化過程的關(guān)鍵分子，也是EGCG發(fā)揮治療作用的重要靶點。
　　 7.EGCG對AngⅡ作用下CFs中AT1R、β-arrestin-1和Gq表達的影響
　　 在AngⅡ刺激下，CFs中AT1aR mRNA水平降低(P＜0.05)，EGCG1×10-5 mol/L體外給藥可以使其恢

31、復(fù)到接近正常水平，但AT1bR mRNA水平?jīng)]有明顯變化，提示AngⅡ主要通過影響AT1aR發(fā)揮活化CFs的作用。進一步檢測發(fā)現(xiàn)，AngⅡ誘導(dǎo)的CFs中β-arrestin-1總表達和胞膜表達均明顯升高(P＜0.01)，而AT1R總表達和胞膜表達均降低(P＜0.01)，Gq蛋白總表達減少(P＜0.01)。EGCG1×10-5 mol/L減少β-arrestin-1的總表達(P＜0.05); EGCG1×10-6和1×10-5 mol/L

32、不同程度減少β-arrestin-1的胞膜表達(P＜0.01和P＜0.05);EGCG1×10-6和1×10-5 mol/L顯著升高AT1R總表達和胞膜表達;然而EGCG對Gq蛋白的表達減少沒有恢復(fù)作用。
　　 8.EGCG對AngⅡ作用下CFs中p-PKC-delta表達的影響
　　 與正常細胞相比，AngⅡ刺激CFs使細胞漿中p-PKC-delta表達明顯減少，EGCG1×10-6和1×10-5 mol/L體外給藥顯

33、著升高降低的胞漿p-PKC-delta水平，但AngⅡ和EGCG均不能影響胞膜p-PKC-delta的表達。
　　 結(jié)論:
　　 1.細胞形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化法共同證實用酶消化法分離心室肌組織得到的貼壁細胞為心肌成纖維細胞。
　　 2.EGCG體外給藥對正常CFs的細胞活力、增殖和膠原合成能力沒有影響，而對AngⅡ誘導(dǎo)下CFs的異?；罨⒃鲋澈湍z原合成有顯著抑制作用。
　　 3.β-arrestin-1是

34、參與AngⅡ介導(dǎo)CFs活化過程的關(guān)鍵分子，β-arrestin-2未發(fā)揮明顯作用。
　　 4.β-arrestin-1調(diào)節(jié)AT1R內(nèi)吞，在CFs的異常活化中可能起到促進作用，EGCG對CFs活力的抑制作用與減少β-arrestin-1表達、抑制AT1R內(nèi)吞有關(guān)。
　　 5.AngⅡ主要通過影響AT1aR及其下游信號通路活化CFs，EGCG通過抑制β-arrestin-1的總表達和胞膜表達，不同程度的恢復(fù)AT1R下游信號分