蒜氨酸原料藥的中試生產(chǎn)工藝及分析方法研究.pdf

1、大蒜作為一種重要的藥用植物，大量研究表明其具有預(yù)防心血管疾病和抗癌等方面的生物活性，中亞地區(qū)包括中國(guó)新疆是大蒜的原產(chǎn)地。蒜氨酸(S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜，alliin)是完整、未受損大蒜里面含量最豐富的硫化物，并且非常穩(wěn)定，它存在于大蒜的細(xì)胞質(zhì)里；當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，蒜氨酸酶從細(xì)胞液向細(xì)胞質(zhì)釋放，蒜氨酸和蒜氨酸酶接觸被迅速轉(zhuǎn)化為一系列新的化合物—蒜辣素及其相似物，蒜辣素(雙烯丙基硫代亞磺酸酯，allicin)被認(rèn)為是大蒜中最重要的活性成分

2、，但它相當(dāng)不穩(wěn)定，易于自身反應(yīng)。按照課題的設(shè)計(jì)思路，蒜氨酸作為大蒜中最主要的原始活性成分及風(fēng)味物質(zhì)來源，將被單獨(dú)提取純化；同時(shí)提取收集大蒜多糖。為了完成蒜氨酸原料藥的中試生產(chǎn)及原料藥質(zhì)量控制中復(fù)雜多組分分析，在前期研究工作的基礎(chǔ)上，完成了如下工作： 首先建立了蒜氨酸和蒜辣素的準(zhǔn)確方便的定量測(cè)定方法。首次采用非衍生化的HPLC-內(nèi)標(biāo)法對(duì)鮮蒜中蒜氨酸定量，在樣品處理時(shí)從6種滅酶方法中確定微波加熱方式使蒜酶滅活最為徹底。此法不僅較之前

3、的衍生化法簡(jiǎn)單方便，也比非衍生化的外標(biāo)法更為準(zhǔn)確，同時(shí)驗(yàn)證并指出了美國(guó)藥典測(cè)定蒜氨酸方法的失誤；該法同樣適于測(cè)定蒜氨酸原料藥及制劑。另外建立了4-MP紫外法快速測(cè)定鮮蒜中蒜辣素的方法，具有快速、方便、價(jià)廉、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)；與英國(guó)藥典測(cè)定結(jié)果一致，該方法可以適應(yīng)測(cè)定蒜氨酸含量和蒜酶活力，同時(shí)可方便應(yīng)用于考察蒜酶動(dòng)力學(xué)特性。從新疆各地鮮蒜50多個(gè)樣品的品質(zhì)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，各地含量普遍較高，均高于USP 0.5％的標(biāo)準(zhǔn)；新疆地域廣，生態(tài)多樣，環(huán)境差

4、異大，大蒜品質(zhì)主要受生境、氣候、土壤及水肥的影響較大，大蒜標(biāo)準(zhǔn)化種植勢(shì)在必行。 第二，在進(jìn)行蒜氨酸提取純化實(shí)驗(yàn)室工藝考察中，確定微波加熱方式蒜酶滅活徹底的時(shí)間；不同濃度乙醇提取蒜氨酸時(shí)，20％較好，不僅提取效率高同時(shí)利于提取溶液較長(zhǎng)時(shí)間存放而不會(huì)腐敗；通過正交設(shè)計(jì)篩選出恰當(dāng)提取次數(shù)為超聲提取3次，料液比為1:3；超濾澄清效果好，且無損失。陽離子交換樹脂法分離純化蒜氨酸時(shí)，從2種候選樹脂中選定001×7型(732)樹脂吸附量較大，

5、適宜的上柱樣品應(yīng)為pH=2、濃度為適中的大蒜提取溶液，水洗多糖的量為6倍柱體積，氨水最佳解吸濃度為0.5mol/L，同時(shí)90％的大蒜多糖得以收集，鮮蒜中蒜氨酸的收率可大于50％。40℃時(shí)70％乙醇對(duì)蒜氨酸粗品結(jié)晶，蒜氨酸純度可達(dá)90％以上。第三，小試工藝可行、穩(wěn)定，原料、中間體和產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法已建立的情況下，我們采用與生產(chǎn)相符的條件進(jìn)行工藝放大研究。在制定中試生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中，考察了隧道式干熱烘干機(jī)殺酶的溫度、時(shí)間和效率，干熱滅酶

6、效率只能達(dá)到70％，待改進(jìn)；改良的篩板使帶皮打漿效果良好，證明非脫皮熟蒜打漿的可行性，減少了工序，降低了成本：提取過程中，20％酒精分別1:3和1:2提取2次，效率達(dá)90％以上；硅藻土板框過濾時(shí)，探索了精濾過程中提取液中預(yù)涂和過濾時(shí)硅藻土的比例分別為3％和1％，并考察硅藻土對(duì)蒜氨酸的吸附損失，濾液澄明度良好，蒜氨酸損失很少：在樹脂吸附分離階段，采用三種簡(jiǎn)便靈敏檢測(cè)手段控制生產(chǎn)過程，分離蒜氨酸的效果與實(shí)驗(yàn)室一致，酸性流分中蒜氨酸收率可達(dá)5

7、0％以上，干燥后蒜氨酸純度達(dá)50％以上；試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)濃縮蒜氨酸洗脫液時(shí)溫度和濃縮時(shí)間對(duì)蒜氨酸損失的具有很大影響。最終蒜氨酸得率和質(zhì)量達(dá)到了設(shè)計(jì)要求。 最后為了了解蒜氨酸原料藥中的復(fù)雜物質(zhì)組成；我們采用正相非衍生化和反相衍生化的HPLC-MS-MS對(duì)不同純度的蒜氨酸原料藥中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，證實(shí)蒜氨酸原料藥中不僅包含蒜氨酸的異構(gòu)體異蒜氨酸和環(huán)蒜氨酸，蒜氨酸同系物甲基蒜氨酸以及蒜氨酸來源物質(zhì)脫氧蒜氨酸以外，還含有精氨酸、胱氨酸、