胃癌細(xì)胞系中Filaggrin基因突變的生物學(xué)意義及分子調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的：探討胃癌細(xì)胞系中FLG基因突變的細(xì)胞生物學(xué)意義及分子調(diào)控機(jī)制。
　　材料和方法：
　　1.研究對象：胃癌細(xì)胞系BGC823、MGC803、SGC7901、AGS、N87和永生化胃黏膜細(xì)胞系GES。
　　2.采用RT-PCR及測序檢測FLG基因在胃癌細(xì)胞系BGC823、MGC803、SGC7901、AGS、N87和永生化胃黏膜細(xì)胞系GES中的表達(dá)；采用Western Blot和細(xì)胞免疫熒光方法檢測Filaggrin

2、蛋白在上述6種細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)。
　　3.構(gòu)建shRNA-FLG質(zhì)粒，建立FLG基因突變的細(xì)胞模型。采用RT-PCR和Western Blot方法對該細(xì)胞模型進(jìn)行鑒定。
　　4.對建立的細(xì)胞模型進(jìn)行細(xì)胞增殖、細(xì)胞克隆形成能力和細(xì)胞周期的檢測。分別以MTT、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞進(jìn)行檢測，并以Western Blot方法檢測細(xì)胞模型中CyclinD1的蛋白水平。
　　5.對建立的細(xì)胞模型進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，采用Wes

3、tern Blot檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)。
　　6.采用Western Blot檢測BGC823中Filaggrin的表達(dá)，在BGC823細(xì)胞中加入IL-6，培養(yǎng)48h后檢測，以未加入IL-6的BGC823細(xì)胞作對照。
　　7.采用Western Blot方法檢測所建細(xì)胞模型中IL-8蛋白及STAT3蛋白的表達(dá)，以空質(zhì)粒vector作對照。
　　結(jié)果：
　　1.在RNA水平中，F(xiàn)LG基因的表達(dá)順序由高到

4、低依次為：N87、MGC803、AGS、SGC7901、GES、BGC823；在蛋白水平中，F(xiàn)ilaggrin的表達(dá)順序由高到低依次為：MGC803、N87、SGC7901、BGC823、GES、AGS。
　　2.選擇滿足實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)條件的BGC823細(xì)胞建立FLG基因突變的細(xì)胞模型：shRNA-FLG-BGC823。
　　3.在shRNA-FLG-BGC823細(xì)胞中，F(xiàn)LG基因表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)ilaggrin蛋白表達(dá)下調(diào)，差異均具

5、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　4.shRNA-FLG-BGC823細(xì)胞經(jīng)MTT檢測，細(xì)胞增值能力（p<0.05）及細(xì)胞的克隆形成能力增強(qiáng)（p<0.05）。經(jīng)細(xì)胞周期檢測，細(xì)胞周期G1出現(xiàn)阻滯。shRNA-FLG-BGC823細(xì)胞中CyclinD1蛋白的表達(dá)明顯降低(p<0.05)。
　　5.在shRNA-FLG-BGC823細(xì)胞中，Bax蛋白表達(dá)未見改變（p>0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(p<0.05)。

6、r>　　6.加入IL-6的BGC823細(xì)胞，F(xiàn)ilaggrin蛋白表達(dá)降低(p<0.05)。
　　7.shRNA-FLG-BGC823細(xì)胞中IL-8蛋白和STAT3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(p<0.05)，
　　結(jié)論：
　　1.構(gòu)建了shRNA-FLG質(zhì)粒，建立了FLG基因突變的細(xì)胞模型shRNA-FLG-BGC823。
　　2.FLG基因突變后，BGC823細(xì)胞在培養(yǎng)早期24h，出現(xiàn)G1期阻滯，細(xì)胞生長停滯。