CHB患者外周血Th17-IL-17表達(dá)水平與疾病的關(guān)系.pdf

1、本研究采集我院感染性疾病科93例CHB患者(其中CHB患者輕度21例,中度37例,重度35例)及28例健康體檢者外周血各7ml,通過(guò)檢測(cè)不同疾病程度CHB患者組與正常對(duì)照組外周血中CD4+T細(xì)胞IL-17的表達(dá),及與Th17細(xì)胞分化相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)情況,并分析其表達(dá)與肝臟損傷標(biāo)志物的關(guān)系,從而進(jìn)一步探討Th17細(xì)胞與CHB患者肝臟病理?yè)p傷所可能存在的關(guān)系。 首先,我們主要采用三種研究方法對(duì)疾病組和健康對(duì)照組外周血Th17細(xì)胞

2、/IL-17的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。采用的檢測(cè)方法主要包括流式細(xì)胞術(shù)(FACS)、熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real time PCR)和酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)。 1、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組外周血Th17細(xì)胞的表達(dá)。我們?nèi)「鹘MEDTA抗凝全血100μl,用100μl含10％小牛血清1640培養(yǎng)基稀釋后,同時(shí)加入50ng/ml PMA、1μg/mlIonomycin和1μg/ml Golgi plug,37度5％CO2孵箱刺激培養(yǎng)

3、5h后標(biāo)記抗人CD4流式抗體,隨后按照BD公司流式穿膜試劑盒操作步驟對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-17、IFN-γ染色,并進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果提示：與正常對(duì)照組相比,中重度CHB患者組外周血CD4+IFN-γ-IL-17+T細(xì)胞(Th17細(xì)胞)比例均明顯升高(P<0.05),而中度與輕度組、輕度與正常對(duì)照組間差異不明顯；各組之間CD4+IFN-γ+IL-17T細(xì)胞(Th1細(xì)胞)比例無(wú)明顯區(qū)別。重度CHB患者CD4+IFN-γIL-17+T細(xì)

4、胞比例雖高于正常對(duì)照,但差異統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著意義。 2、Real time PCR方法檢測(cè)各組外周血CD4+T細(xì)胞內(nèi)IL-17及Th17細(xì)胞分化重要轉(zhuǎn)錄因子RORγt的mRNA表達(dá)水平。我們利用外周血CD4+T細(xì)胞富集試劑盒和淋巴細(xì)胞分離液分離出各組外周血CD4+T細(xì)胞,在不經(jīng)任何刺激培養(yǎng)和經(jīng)抗人CD3抗體及PMA刺激4h的情況下分別對(duì)各組CD4+T細(xì)胞通過(guò)Real time PCR技術(shù)進(jìn)行IL-17、RORγt mRNA水平的定

5、量檢測(cè)。結(jié)果顯示：經(jīng)過(guò)刺激培養(yǎng)后,重度CHB患者組IL-17、RORγt的mRNA表達(dá)水平高于輕度組和正常對(duì)照組(P<0.05),且IL-17的mRNA表達(dá)在中度與正常對(duì)照組間也有差異,但重度與中度組間,輕度與正常對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3、ELISA方法檢測(cè)外周血血清及CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-17的表達(dá)。我們對(duì)各組外周血血清及經(jīng)抗人CD3抗體及抗人CD28抗體刺激72h后的CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清行IL-17 ELIS

6、A檢測(cè)以進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn),與流式細(xì)胞儀和Real timePCR檢測(cè)結(jié)果類(lèi)似的是：經(jīng)刺激培養(yǎng)后重度CHB患者組培養(yǎng)上清IL-17表達(dá)水平高于中度、輕度和正常對(duì)照組(P<0.05);雖然中度組較輕度和正常對(duì)照組而言也升高,但變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；輕度組和正常對(duì)照組間仍無(wú)差別。而外周血血清IL-17的表達(dá)各組間差異不明顯。其次,由于以上結(jié)果均支持中重度CHB患者體內(nèi)存在著Th17細(xì)胞的高表達(dá),因此我們運(yùn)用Real time PCR技

7、術(shù)進(jìn)一步分析了目前認(rèn)為和IL-17共表達(dá)于Th17細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-22,以及促進(jìn)Th細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β、IL-6、IL-1β在各組外周血CD4+T細(xì)胞的mRNA表達(dá)情況。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：重度CHB患者組CD4+T細(xì)胞表達(dá)TGF-β、IL-6、IL-1β均高于正常對(duì)照組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)我們將分離出的CD4+T細(xì)胞經(jīng)抗人CD3抗體及PMA刺激4h后,再對(duì)上述細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)后結(jié)果顯示：重度CHB患

8、者組TGF-β、IL-1β表達(dá)水平與中度、輕度、正常對(duì)照組之間的差異較未經(jīng)刺激時(shí)明顯增大,具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其余各組間的差異不顯著；重度組IL-6的表達(dá)水平較正常對(duì)照組相比也明顯升高。而IL-22的表達(dá)水平在刺激前后各組間變化均不明顯。 最后,對(duì)以上結(jié)果進(jìn)行分析后我們認(rèn)為CHB患者體內(nèi)存在著Th17細(xì)胞及其分化相關(guān)因子的高表達(dá),值得我們進(jìn)一步研究其免疫功能與疾病之間可能存在的相互關(guān)系。因此,我們進(jìn)一步對(duì)CHB患者組外

9、周血血清HBV DNA載量、肝臟損傷標(biāo)志物ALT進(jìn)行檢測(cè),并由此分析外周血Th17細(xì)胞所占CD4+T細(xì)胞比例與患者外周血血清ALT表達(dá)水平、HBV DNA載量之間是否存在一定相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)疾病組外周血Th17細(xì)胞所占比例與其血清ALT水平成正相關(guān)(P<0.01),而與HBV DNA載量無(wú)明顯相關(guān)性。 本研究中,我們首先運(yùn)用了三種檢測(cè)方法對(duì)疾病組和健康對(duì)照組外周血Th17細(xì)胞/IL-l7的表達(dá)水平進(jìn)行了反復(fù)檢測(cè)和驗(yàn)證。我們的研究

10、結(jié)果提示：隨著CHB患者疾病嚴(yán)重程度的加大,外周血CD4+IFN-γ-IL-17+T細(xì)胞(Th17細(xì)胞)所占的比例、經(jīng)抗人CD3抗體及PMA刺激4h后的CD4+T細(xì)胞內(nèi)IL-17、RORγt的mRNA表達(dá)水平、經(jīng)抗人CD3抗體及抗人CD28抗體刺激72h后的CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-17的表達(dá)水平均明顯上調(diào)。隨后,當(dāng)我們進(jìn)一步分析與Th17細(xì)胞分化相關(guān)的細(xì)胞因子TGF-β、lL-6、IL-1β以及共表達(dá)于Th17細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子IL-

11、22在外周血CD4+T細(xì)胞內(nèi)的mRNA表達(dá)水平時(shí)發(fā)現(xiàn)：在經(jīng)過(guò)抗人CD3抗體及PMA刺激4h后,重度CHB患者組TGF-β、IL-6、IL-1β表達(dá)水平高于正常對(duì)照組,而IL-22的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。 最后,我們進(jìn)一步研究Th17細(xì)胞與CHB患者HBV載量和肝臟損傷的關(guān)系時(shí),我們發(fā)現(xiàn)患者組外周血Th17細(xì)胞所占比例與其血清ALT水平呈正相關(guān)(P<0.01),而與HBV DNA載量無(wú)明顯相關(guān)性。本研究提示Th17細(xì)胞可能在參與CH

12、B疾病的病程進(jìn)展及肝臟損傷中發(fā)揮一定作用。雖然,疾病各組間及輕度與正常對(duì)照組之間的差異統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著意義(這一現(xiàn)象可能在進(jìn)一步擴(kuò)大病例數(shù)后得到解決),但從整體趨勢(shì)上來(lái)看,外周血Th17細(xì)胞所占比例、CD4+T細(xì)胞刺激培養(yǎng)上清IL-17的表達(dá)水平及IL-17、RORγt的mRNA表達(dá)水平均隨疾病加重而升高。由于TGF-β、IL-6、IL-1β為促進(jìn)Tn17細(xì)胞分化的重要細(xì)胞因子,與此相符的是,我們?cè)谘芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)重度CHB患者外周血刺激培養(yǎng)

13、的CD4+T細(xì)胞存在著上述細(xì)胞因子的高表達(dá)。同時(shí),業(yè)已有大量文獻(xiàn)報(bào)道CHB患者外周血血清存在著TGF-β、IL-1β等細(xì)胞因子的表達(dá)上調(diào),但我們所觀察到的CHB患者外周血Th17細(xì)胞表達(dá)水平的升高是否與此直接相關(guān)還值得進(jìn)一步證實(shí)。在本實(shí)驗(yàn)研究中,無(wú)論是對(duì)外周血血清直接檢測(cè)IL-17,還是對(duì)分離出的未經(jīng)體外刺激的CD4+T細(xì)胞直接檢測(cè)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平,我們都沒(méi)有檢測(cè)到疾病組與對(duì)照組間統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差別；但在經(jīng)過(guò)體外刺激培養(yǎng)后這一

14、差異有了明顯的提高,且達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的區(qū)別。由于報(bào)道認(rèn)為HBV感染后發(fā)生慢性乙型肝炎時(shí),機(jī)體的免疫反應(yīng)很弱,并不能檢測(cè)到特異性的T細(xì)胞反應(yīng)。 另外,近來(lái)的研究報(bào)道認(rèn)為T(mén)h17細(xì)胞在高表達(dá)IL-17的同時(shí),也表現(xiàn)出產(chǎn)生大量的IL22。然而,與IL-17共表達(dá)于Th17細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-22在本研究中并未呈現(xiàn)出與IL-17相應(yīng)的變化趨勢(shì),這一現(xiàn)象目前我們并不能很好的解釋。最近也有研究提出體內(nèi)可能存在著另一群Th17細(xì)胞,它們并

15、不高表達(dá)IL-22,而主要高表達(dá)IL-17。因此,是否我們所發(fā)現(xiàn)的這群在CHB患者外周血增高的Th17細(xì)胞主要為這樣一群細(xì)胞?在本研究中這一群僅主要高表達(dá)IL-17的CD4+T細(xì)胞在CHB患者外周血出現(xiàn)了明顯升高,且隨患者疾病程度的加重而增加。然而,這樣一群主要高表達(dá)IL-17的CD4+T細(xì)胞-Th17細(xì)胞在CHB疾病進(jìn)展中具體致病性如何?在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)CHB患者外周血Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例與患者肝臟損傷指標(biāo)-ALT的

16、表達(dá)呈明顯正相關(guān),這一現(xiàn)象提示我們Th17細(xì)胞在CHB患者肝臟損傷方面發(fā)揮重要作用。另外,Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例與HBV病毒載量無(wú)明顯相關(guān)性,這也提示我們可能Th17細(xì)胞的多少與病毒含量直接聯(lián)系并不大,而與病毒感染后引起的免疫反應(yīng)或者組織損傷有關(guān)。但是,Th17細(xì)胞和IL-17在CHB患者體內(nèi)的表達(dá)上調(diào)及其與ALT表達(dá)的正相關(guān)性是由于HBV這樣一種病毒感染機(jī)體后所直接引起還是由于肝臟損傷之后所間接引起的還值得我們進(jìn)一步研究證

17、實(shí)。 CHB的發(fā)病與多種因素相關(guān),病毒成分、肝臟損傷以及機(jī)體免疫系統(tǒng)的相互作用在疾病的持續(xù)性發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色。CHB的治療應(yīng)包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、改善肝功能和抗肝纖維化。一般認(rèn)為乙型肝炎病毒本身致病性有限,機(jī)體在清除病毒的過(guò)程中造成的免疫損害是造成肝臟病變的原因。但是在疾病的自然發(fā)展及抗病毒藥物清除病毒的過(guò)程均可發(fā)現(xiàn)病毒水平和人體免疫力有相關(guān)性?？祻?fù)時(shí),先出現(xiàn)病毒下降,再出現(xiàn)臨床病情緩解；病情復(fù)發(fā)時(shí),則出現(xiàn)病毒水平上升,然后出現(xiàn)病