線粒體在壓力誘導(dǎo)椎間盤細(xì)胞凋亡和能量代謝障礙中的作用及其實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 兔椎間盤細(xì)胞氣壓加壓培養(yǎng)模型的建立
　　 目的:建立兔椎間盤細(xì)胞體外氣壓加壓培養(yǎng)模型，觀察在持續(xù)靜壓力培養(yǎng)12h、24h和36h后兔椎間盤細(xì)胞生物學(xué)行為改變，評(píng)價(jià)該細(xì)胞加壓模型的優(yōu)缺點(diǎn)。
　　 方法:將體外培養(yǎng)的兔纖維環(huán)和髓核細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組（不加壓）、加壓12h組、24h組和36h組，在1MPa 壓力下干預(yù)后觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、增殖活性和細(xì)胞基質(zhì)（COA Ⅰ、Ⅱ及AGG）表達(dá)改變。
　　 結(jié)果:

2、加壓培養(yǎng)后，倒置相差顯微鏡下纖維環(huán)和髓核細(xì)胞均有不同程度密度減低和細(xì)胞體積減小，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形變。加壓24h和36h 可見明顯纖維環(huán)和髓核細(xì)胞增殖活性抑制；髓核細(xì)胞加壓時(shí)間>12h后即出現(xiàn)AGG的mRNA表達(dá)下降，而加壓時(shí)間>24h后出現(xiàn)COAⅡ的mRNA表達(dá)下降；纖維環(huán)細(xì)胞加壓時(shí)間>24h后COAⅠ、Ⅱ的mRNA 均出現(xiàn)不同程度的表達(dá)下降。
　　 結(jié)論:該細(xì)胞氣壓加壓培養(yǎng)裝置可短期內(nèi)模擬機(jī)械應(yīng)力導(dǎo)致的兔椎間盤細(xì)胞退變改變，為實(shí)驗(yàn)

3、室實(shí)施體外壓力細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提供了一種簡(jiǎn)單、安全的方案。
　　 第二部分線粒體凋亡途徑參與過度壓力誘導(dǎo)的兔椎間盤細(xì)胞的凋亡
　　 目的:探討過度機(jī)械壓力刺激誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的兔纖維環(huán)和髓核細(xì)胞凋亡的主要信號(hào)途徑。
　　 方法:將體外培養(yǎng)的兔椎間盤纖維環(huán)和髓核細(xì)胞給予1MPa的持續(xù)機(jī)械壓力干預(yù)12h、24h和36h，另設(shè)不加壓的對(duì)照組，各4組。各組纖維環(huán)和髓核細(xì)胞達(dá)到加壓時(shí)間后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，熒光顯微鏡、熒光分光光

4、度計(jì)和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位平均相對(duì)熒光強(qiáng)度，酶標(biāo)儀檢測(cè)caspase-8，9，3 活性。
　　 結(jié)果:流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示纖維環(huán)細(xì)胞加壓24h組、36h組和髓核細(xì)胞加壓12h組、24h組和36h組均出現(xiàn)明顯細(xì)胞凋亡增加；熒光顯微鏡、熒光分光光度計(jì)和激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，加壓24h組和36h組的纖維環(huán)和髓核細(xì)胞以綠色熒光為主，紅色熒光明顯減少，細(xì)胞線粒體膜電位均明顯下降；酶標(biāo)儀結(jié)果顯示髓核細(xì)胞組加壓后caspas

5、e-8，9，3 活性均升高，而纖維環(huán)細(xì)胞組加壓后caspase-9 活性明顯增強(qiáng)，caspase-8 活性無明顯變。
　　 結(jié)論:1MPa 靜壓力加壓時(shí)間>24h 作為過度機(jī)械壓力可以明顯誘導(dǎo)椎間盤纖維環(huán)和髓核細(xì)胞的凋亡。機(jī)械壓力誘導(dǎo)的纖維環(huán)細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑主要是由線粒體依賴的凋亡途徑參與的，而線粒體依賴途徑和DISC 途徑（非線粒體依賴途徑）二者則均參與了髓核細(xì)胞的凋亡。
　　 第三部分過度壓力對(duì)兔內(nèi)外層纖維環(huán)細(xì)胞線粒

6、體功能和超微結(jié)構(gòu)的影響
　　 目的:研究過度機(jī)械壓力對(duì)體外藻酸鹽串珠培養(yǎng)的兔椎間盤內(nèi)外層纖維環(huán)細(xì)胞線粒體功能和超微結(jié)構(gòu)的影響。
　　 方法將體外藻酸鹽串珠培養(yǎng)的兔纖維環(huán)細(xì)胞分為四組：OA1組為外層纖維環(huán)細(xì)胞，不加壓；OA2組為外層纖維環(huán)細(xì)胞，1MPa 壓力干預(yù)24h；IA1組為內(nèi)層纖維環(huán)細(xì)胞，不加壓；IA2組，內(nèi)層纖維環(huán)細(xì)胞，1MPa 壓力干預(yù)24h。加壓完成后，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)ATP 產(chǎn)量，熒光顯微鏡和熒光分光光度計(jì)檢測(cè)

7、線粒體膜電位和活性氧簇的釋放，分光光度計(jì)檢測(cè)4 種線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性和透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果:兔纖維環(huán)細(xì)胞經(jīng)1MPa 壓力作用24h后，與各對(duì)照組相比，內(nèi)外層纖維環(huán)細(xì)胞均可見ATP 產(chǎn)量明顯減少，活性氧簇釋放增加，線粒體膜電位顯著下降，細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)損傷的病理改變；外層纖維環(huán)細(xì)胞呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ活性相比對(duì)照組顯著下降，而內(nèi)層纖維環(huán)細(xì)胞呼吸鏈酶復(fù)合物僅Ⅲ和Ⅳ活性相比對(duì)照組明顯下降。外層纖維環(huán)