煙草航天育種突變體T-cldf及其相關(guān)ESTs的研究.pdf

1、煙草(Nicotiana tabacum)屬于茄科(So1anaceae)煙草屬(Nicotiana)，是世界性種植的經(jīng)濟(jì)作物。中國(guó)是煙草大國(guó)，既是最大的煙葉生產(chǎn)國(guó)，也是最大的煙葉消費(fèi)國(guó)，但并不是煙草強(qiáng)國(guó)。中國(guó)的煙草育種工作起步較晚，雖然近年來(lái)取得了很大的進(jìn)步，但是煙葉的生產(chǎn)對(duì)引進(jìn)品種具有一定的依賴性。加強(qiáng)中國(guó)的煙草育種研究對(duì)中國(guó)煙草行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有非常重要的理論和實(shí)踐意義。 航天育種是航天技術(shù)和育種技術(shù)相結(jié)合的一種新的育種

2、手段，本質(zhì)上屬于誘變育種，因?yàn)樘窄h(huán)境中存在微重力、宇宙輻射和高能離子等誘變因素。在我國(guó)，結(jié)合中國(guó)先進(jìn)的航天技術(shù)進(jìn)行煙草航天育種工作，創(chuàng)新煙草種質(zhì)資源，促進(jìn)煙草育種進(jìn)程。 本研究以搭載中國(guó)2002年3月發(fā)射的“神州三號(hào)”返回式衛(wèi)星太空飛行(軌道傾角42°，軌道半徑343 km)歷時(shí)162小時(shí)的煙草栽培品種K346(Nicotiana　tabacum(L)cv.K346)種子及其留在地面作對(duì)照的K346種子(野生型)為材料，研究空

3、間因素對(duì)煙草種質(zhì)的影響，探索煙草航天育種的可行性。 經(jīng)過(guò)太空飛行返回后的煙草種子(SPO)，和其留在地面作對(duì)照的K346種子(野生型)種植于中國(guó)貴州省煙草研究所的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地，煙草播種、育苗、移栽按照煙草栽培的常規(guī)管理，在煙草整個(gè)生育期，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育狀況及形態(tài)特征進(jìn)行觀察和突變體篩選。并采用套袋自交單株留種的方式對(duì)獲得的擬突變體株系的自交子代(SPl-SP4)進(jìn)行連續(xù)的觀察，子一代(SPl)至子四代(SP4)都維持著同樣突變性狀的突

4、變株系，認(rèn)為是可遺傳的突變體。我們篩選獲得了一個(gè)命名為T-C1df(Crinkly Leaf and Delay F1owering Mutant of Tobacco)的煙草突變體株系，它具有皺葉及延遲開花的特性。 表型觀察表明，煙草突變T-Cldf與其野生型葉片形態(tài)之間存在著很明顯的差異，突變體T-CIdf自第六真葉開始表現(xiàn)出葉片上表面起皺成波浪狀、尤其是次級(jí)脈之間葉片上表面生長(zhǎng)凸出，而下表面凹陷，但是野生型的葉片表面平整，

5、上下表面幾乎沒(méi)有明顯的凹凸。網(wǎng)室中苗期的突變體T-Cldf和移栽到煙草實(shí)驗(yàn)場(chǎng)成熟期的突變體T-cldr都能觀察到其葉片明顯起皺的表型特征。我們用掃描電鏡的方法觀察并統(tǒng)計(jì)葉片表面的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，在上表面，突變體T-cldf葉片表面單位面積的細(xì)胞數(shù)比野生型的多約13％，而其葉片表面單個(gè)細(xì)胞的面積比野生型的小約11％；然而在下表面，它們之間單位面積的細(xì)胞數(shù)沒(méi)有差別，細(xì)胞平均大小幾乎一致。這說(shuō)明，突變體T-CIdf葉片特異性狀是由葉片上下表面生長(zhǎng)速

6、率失衡引起的。煙草突變體T-Cldf的另一個(gè)明顯特征是，生育期比其野生型長(zhǎng)，表現(xiàn)為開花時(shí)間延遲，從移栽到第一朵花開的時(shí)間，煙草突變體T-Cldf比其野生型延遲約19d。 按照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(1996.YC／T39)抗病性的田間調(diào)查統(tǒng)計(jì)方法，調(diào)查突變體T-CIdf及其野生型對(duì)煙草青枯病(細(xì)菌性病害)、煙草黑脛病(真菌性病害)和煙草普通花葉病(病毒性病害)的抗性，分析結(jié)果表明，與其野生型相比，突變體T-CIdf在抗真菌性病害方面有所增

7、強(qiáng)，如抗煙草黑脛病病指平均值從26.2下降到20.8。 應(yīng)用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(AFLP)分析突變體T-CIdf與其野生型遺傳多態(tài)性的結(jié)果表明，用選擇性擴(kuò)增引物E+3／M+3(Ecog I—ACA和Mse I—CTG)擴(kuò)增，從突變體T-CIdf中檢測(cè)到3條特異性差異條帶，大小分別為250 bp，170bp和140bp：從野生型中檢測(cè)到2條大小分別為160bp和125bp的差異性條帶。這說(shuō)明煙草突變體產(chǎn)T-CIdf的特異性狀的

8、產(chǎn)生是由于空間環(huán)境誘導(dǎo)遺傳物質(zhì)的變化引起的。 同時(shí)我們以突變體T-CIdf葉片為Tester材料，以其野生型葉片為Driver材料，應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)(SSH)建立了SSH文庫(kù)。隨機(jī)挑選的部分克隆，經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)和點(diǎn)雜交篩選的陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)序，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST分析。獲得62個(gè)ESTs(已登錄GenBank數(shù)據(jù)庫(kù))，按照其功能可以分為7類。其中與光合作用相關(guān)的ESTs有9個(gè)，與結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)的有

9、4個(gè)，與生理代謝的酶相關(guān)的有11個(gè)；還有11個(gè)基因功能信息未知的ESTs和20個(gè)在煙草中首先獲得的ESTs。對(duì)ZIP蛋白(GenBankAccessNo.EBl02902)，葉片表面蛋白(GenBank Access No.EB102896)，14-3-3蛋白(GenBank Access No．EBl02898)和水孔蛋白(GenBank Access No.EB041772)相關(guān)的ESTs在突變體T-cldf及其野生型的葉片中進(jìn)行半