青風藤提取物的藥學和藥理學初步研究.pdf

1、目的：本課題研究目的是開發(fā)中藥青風藤中對抗阿片類藥物依賴、治療戒斷癥狀的天然有效成分，并進行初步的藥效學研究。采用正交設(shè)計法優(yōu)選切合實際的最佳制劑工藝。質(zhì)量控制方面將對青風藤中所含主要活性成分青藤堿進行薄層色譜定性鑒別的研究，并采用高效液相色譜法進行含量測定研究，初步確定其含量限度。對本研究所采用的含量測定方法進行方法學研究，制訂控制該制劑質(zhì)量的質(zhì)控指標。通過急性毒性試驗，觀察青風藤提取物對小鼠的急性毒性反應及死亡情況，為該藥臨床應用的

2、安全性提供科學依據(jù)。通過動物模型，觀察青風藤提取物對嗎啡依賴大、小鼠催促戒斷癥狀的治療作用，為青風藤提取物的臨床應用提供藥理學依據(jù)。 方法： 1．青風藤提取工藝考察實驗：對有效成分含量影響較大的因素有煎煮時間、煎煮次數(shù)、作為溶劑的乙醇濃度，加入溶劑的量等。根據(jù)青藤堿既溶于水又可溶于醇的特性，選用不同濃度的乙醇為溶劑，將乙醇濃度和煎煮時間、次數(shù)及溶液用量構(gòu)成四個主要影響因素，每因素各設(shè)3水平，因此，選用L9(3<'4>)正

3、交設(shè)計表。按正交表中給定的實驗條件進行正交試驗，重復3次，以平均青藤堿的含量(mg/ml)為考察指標篩選最佳條件。 2 青風藤提取工藝驗證實驗：按最佳工藝驗證3批，取相當與1g生藥量的干膏測青藤堿的含量。 3 青風藤定性鑒別實驗：照薄層色譜法(《中國藥典》2005年版一部，附錄VI B)試驗，吸取青風藤成品供試品溶液10μl，青風藤對照藥材溶液10μl，青藤堿對照品溶液5μl，分別點于同一2％氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層

4、板上，以甲苯-甲醇-乙酸乙酯-水(2:2:4: 1)10℃以下放置的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。依次噴碘化鉍鉀試液和亞硝酸鈉乙醇試液。供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。 4青風藤含量測定波長選擇：按色譜條件對對照品溶液和樣品溶液進行檢測，根據(jù)青藤堿對照品和樣品中青藤堿的紫外吸收圖譜，確定青藤堿最大吸收波長。 5 青藤堿對照品標準曲線的繪制：精密吸取對照品溶液5、10、15、20

5、、30μl，在高效液相色譜儀中進行測定，以峰面積為縱座標，進樣量(μg)為橫坐標，繪制標準曲線。 6 精密度實驗：精密吸取青藤堿對照品溶液10μl，重復連續(xù)進樣5次，測定供試品中青藤堿的峰面積值。 7 穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液，分別在制備后0、2、16、18、22小時進行青藤堿峰面積測定，每次進樣10μl。 8 重現(xiàn)性試驗：同一批樣品干膏精密稱取樣品1g，共5份，制備成供試品溶液，按選定的方法測定，每次進樣10μ

6、l。 9 回收率測定：取青風藤干膏共5份，分別精密稱取1g，按樣品含量測定方法測定其青藤堿的含量，精密加入青藤堿對照品(青藤堿含量為2.722mg/ml)1ml，計算青藤堿的回收率。 10 樣品中青藤堿的含量測定：取本品，胺照供試品溶液制備方法制備，按選定的方法，自動進樣供試品溶液10μl，測定供試品溶液中青藤堿的峰面積值，計算含量。 11 青風藤提取物急性毒性試驗：取昆明小鼠40只，♂♀各半，隨機分成2組(n=

7、20)，即空白對照組、青風藤提取物組。2組動物經(jīng)禁食12h(飲水不限)后，分別 ig 給予等容量生理鹽水和青風藤提取物藥液，在一天內(nèi)連續(xù)給藥兩次(9：00，18：00)，給藥后小鼠自由進食飲水。藥后24小時內(nèi)嚴密觀察受試動物的情況，以后每天觀察3次，連續(xù)14天，于第15天稱體重后將小鼠處死，解剖后肉眼觀察其心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸等主要臟器的病理學改變。12 對嗎啡依賴動物催促戒斷癥狀的治療實驗： (1)青風藤提取物對嗎啡

8、依賴大鼠戒斷癥狀的治療實驗按劑量遞增法造成嗎啡依賴大鼠模型。取SD大鼠60只，雌雄各半，sc嗎啡，每天3次(8：00、14：00、20：00，)，劑量為5、10mg/kg各4天，15、20mg/kg各3天。注射量為0.2ml/100g。于第15天上午8：00將大鼠隨機分為6組，每組10只，然后分別給予不同的處理：①組為續(xù)用嗎啡組，20mg/kg/日，(0.2ml/100g)；②組為戒斷模型組，ig等容量的生理鹽水；③-⑤分別為青風藤提取

9、物低、中、高劑量組，分別ig青風藤提取物0.4g/kg、0.8g/kg和1.6g/kg的藥液，各組給藥體積相同(1ml/100g)，但濃度不同；⑥組ig青藤堿45mg/kg。給藥45 min后用納洛酮(4 mg/kg，ip)進行催促，觀察記錄大鼠的戒斷反應，并于60 min時稱量大鼠體重。 (2)青風藤提取物對嗎啡依賴小鼠戒斷癥狀的治療實驗按劑量遞增法復制嗎啡依賴小鼠模型。取昆明小鼠1 00只，雌雄各半，每天給予sc 嗎啡，

10、每天給藥2次(8：30，16：30)，給藥體積為0.2 ml/1 0g。劑量從25 mg/kg起，逐日遞增，于第6天增至1 50 mg/kg，即制成嗎啡依賴的小鼠模型。于第7天進行納洛酮催促戒斷試驗。各組分別給予不同的處理：①組為空白對照組，ig等體積生理鹽水(0.2ml/10g)；②-④分別為青風藤提取物低、中、高劑量組，按各組劑量0.8g/kg、1.6g/kg和3.2g/kg，ig給藥，給藥體積相同(均為0.3ml/10g)，濃度不

11、同；⑤組ig青藤堿(60mg/kg)。藥后45min給予納洛酮(8：mg/kg，ip)催促，觀察30min內(nèi)小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)及1h內(nèi)的體重變化。 結(jié)果： 1．經(jīng)篩選的最佳制劑工藝為：處方藥材加8倍量70％乙醇，提取2次，每次2h。 2按最佳工藝驗證3批，取相當與1g生藥量的干膏測青藤堿的含量，結(jié)果青藤堿含量基本穩(wěn)定，說明工藝較穩(wěn)定。 3 經(jīng)篩選的最佳制劑工藝所得成品中青風藤色譜斑點清晰，與對照品斑點的位

12、置和顏色均一致。 4 根據(jù)青藤堿對照品和樣品中青藤堿的紫外吸收圖譜，在262nm處有最大吸收，故選定262nm為青藤堿的檢測波長。 5 測定結(jié)果表明，青藤堿對照品在進樣量2.57μg～15.42μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。 6 RSD(％)=0.99，結(jié)果表明精密度良好。 7 結(jié)果表明供試品溶液在制備后22小時內(nèi)穩(wěn)定。 8 重現(xiàn)性好RSD(％)=1.66，結(jié)果表明，本法測定青藤堿的重現(xiàn)性良好。

13、 9 回收率為99.49％，RSD(％)=0.66，根據(jù)含量測定結(jié)果，表明回收率結(jié)果良好。 10 含量測定結(jié)果，本品每1g含青風藤以青藤堿(c<,19>H<,23>NO<,4>)計，不得少于4.4 mg。 11 青風藤提取物以最大濃度、最大給藥容積一天兩次ig給藥后，觀察14天未見動物死亡。 12(1)青風藤提取物3個劑量組的戒斷癥狀分值均低于戒斷模型組，其中中、高劑量組的戒斷癥狀分值略高于單體青藤堿組，但無

14、明顯差異，P>0.05。 (2)給小鼠連續(xù)sc嗎啡6天后，經(jīng)納洛酮催促，空白對照組小鼠出現(xiàn)明顯的跳躍反應，跳躍小鼠為100％。青風藤提取物ig給藥后，各劑量組小鼠出現(xiàn)跳躍反應的個數(shù)及次數(shù)均有所減少，與空白對照組比較，中、高劑量組及單體青藤堿組均顯著減少，P<0.05。青風藤提取物高劑量組與青藤堿組比較，P<0.05，差異顯著。 結(jié)論： 1．工藝驗證實驗結(jié)果表明青藤堿含量基本穩(wěn)定，說明優(yōu)選工藝較穩(wěn)定。 2．

15、根據(jù)方法學研究結(jié)果，試驗證明，該含量測定方法準確度高重現(xiàn)性好，因此可采用本法測定青風藤提取物中青藤堿的含量。3 青風藤提取物對小鼠的最大日給藥劑量為64 g/kg，相當于臨床成人日用劑量的914倍。表明本品是一種低毒、安全的中藥制劑。 4 嗎啡依賴大鼠催促戒斷治療實驗結(jié)果表明，青風藤提取物3個劑量組在戒斷癥狀最重的前三天均能明顯抑制戒斷大鼠的戒斷癥狀和體重下降。 5 青風藤提取物對嗎啡依賴小鼠催促戒斷癥狀具有治療作用，能