水蛭酶解提取物和淫羊藿苷抑制動脈粥樣硬化進展的藥理學機制研究.pdf

1、研究目的：
　　內(nèi)皮功能紊亂假說認為動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)基本發(fā)展過程是由內(nèi)皮功能紊亂(endothelial dysfunction)開始，修飾后的低密度脂蛋白(modified LDL，主要是氧化型ox-LDL)通過內(nèi)皮細胞的間隙進入內(nèi)皮下層，而發(fā)生了功能紊亂的內(nèi)皮細胞表面表達的粘附因子增加（如E選擇素，P選擇素，ICAM-1，VCAM-1等），使血液循環(huán)中的單核細胞易粘附于血管內(nèi)皮表面，進而單核

2、細胞在其釋放的趨化因子的作用下遷移至內(nèi)皮下層，這些單核細胞在集落刺激因子作用下分化為巨噬細胞，然后吞噬內(nèi)皮下層的修飾后的低密度脂蛋白，成為泡沫細胞，此時即可形成AS早期的脂質(zhì)條紋。當巨噬細胞吞噬了過多的低密度脂蛋白成為泡沫細胞后，其會凋亡、裂解致使脂質(zhì)釋放，并進一步在內(nèi)皮下層堆積。同時巨噬細胞及泡沫細胞還會釋放各種趨化因子，招募更多的巨噬細胞及平滑肌細胞遷移到內(nèi)皮下層。隨著時間的推移，上述病理逐漸發(fā)展，動脈粥樣斑塊也不斷增大。巨噬細胞及

3、泡沫細胞及已經(jīng)凋亡的細胞及脂質(zhì)顆粒構(gòu)成了粥樣斑塊的脂質(zhì)核心，而血管平滑肌細胞從血管中膜遷移至內(nèi)皮下，形成覆蓋脂質(zhì)核心的纖維帽結(jié)構(gòu)。復(fù)雜斑塊可依照其中平滑肌細胞構(gòu)成的纖維帽的厚薄分為穩(wěn)定型斑塊和不穩(wěn)定型斑塊。穩(wěn)定型斑塊纖維帽厚，不容易破裂，在血管內(nèi)膜下逐漸增大而導致管腔狹窄。不穩(wěn)定型斑塊由于纖維帽較薄，容易發(fā)生破裂，釋放出內(nèi)容物，而引起血小板聚集，形成血栓。
　　中藥水蛭作為在臨床上被廣泛使用的一味傳統(tǒng)中藥，具有悠久的歷史。中醫(yī)藥理

4、論認為，水蛭具有“破血、逐瘀”的效果，雖然已有很多研究證明了水蛭的抗凝抗血栓作用，而其在臨床中許多非凝血類疾病中的應(yīng)用，表明其的藥理學機制尚未被完全闡明。
　　水蛭酶解提取物(leech enzymolysis extract，LEE)是使用生物酶解方法，模擬人體消化過程制備的一種中藥水蛭粗提物，其在動脈粥樣硬化中的作用尚未闡明。
　　本研究基于中藥水蛭的藥理學研究和血管內(nèi)皮功能紊亂假說的研究基礎(chǔ)，對中藥水蛭酶解提取物在抑制

5、動脈粥樣硬化進展方面的藥理學機制從動物、細胞及分子層面進行了綜合性研究。
　　研究方法：
　　(1)通過動物實驗驗證LEE是否能夠抑制動脈粥樣硬化進展。
　　使用ApoE敲除小鼠作為模型動物，給予高膽固醇飼料飼養(yǎng)12周，至18周齡后，超聲生物顯微鏡檢查確認動物已有動脈粥樣硬化斑塊形成后，實驗動物按照體重排序，隨機數(shù)表法分為7組:
　　空白對照組，不給于任何藥物，仍然繼續(xù)給予高膽固醇飼料飼養(yǎng);
　　水蛭酶解提

6、取物組，分別給予0.02g/kg，0.1g/kg和0.5g/kg三個劑量水平的藥物;
　　淫羊藿苷組，分別給予30mg/kg和60mg/kg兩個劑量水平的藥物;
　　辛伐他汀組，給予10mg/kg辛伐他汀。
　　分組后持續(xù)給藥飼養(yǎng)12周，至30周齡后，解剖進行實驗取材。
　　(2)超聲生物顯微鏡檢查評價LEE抗動脈粥樣硬化效果
　　ApoE敲除小鼠在飼養(yǎng)至30周齡后，行UBM檢查，測量主動脈弓處斑塊形成情況

7、及主動脈弓處血管內(nèi)外徑，以評價藥物的抗動脈粥樣硬化效果。
　　(3)冰凍組織切片油紅O染色評價LEE抗動脈粥樣硬化效果
　　取小鼠心臟，制成冰凍組織切片后，油紅O染色方法顯示主動脈根部的斑塊大小，以評價藥物的抗動脈粥樣硬化效果。
　　(4)冰凍組織切片MOMA-2染色評價LEE抗動脈粥樣硬化效果
　　取小鼠心臟，制成冰凍組織切片后，使用免疫組化染色方法，用MOMA-2抗體顯示主動脈中單核巨噬細胞浸潤情況，以評價藥

8、物的抗動脈粥樣硬化效果，及可能的作用機制。
　　(5)ELISA檢測小鼠血清中與單核巨噬細胞粘附遷移相關(guān)的細胞因子。
　　(6)構(gòu)建TNF-α誘導的內(nèi)皮細胞功能紊亂細胞模型。使用TNF-α刺激誘導的內(nèi)皮細胞激活，建立內(nèi)皮細胞功能紊亂細胞模型，用來研究LEE對內(nèi)皮細胞的作用。
　　(7)粘附實驗驗證LEE對內(nèi)皮細胞異常激活的抑制作用。
　　(8)遷移實驗驗證LEE對內(nèi)皮細胞異常激活的抑制作用。
　　(9)we

9、stern blot檢測與內(nèi)皮細胞粘附和遷移作用相關(guān)的細胞因子。
　　(10)檢測LEE抑制內(nèi)皮細胞異常激活中NFκB的激活和核轉(zhuǎn)移作用。
　　(11)檢測LEE抑制MAPK信號通路中相關(guān)蛋白p38，ERK，JNK的磷酸化情況。
　　(12)qPCR檢測小鼠主動脈血管壁中CX3CR1和CX3CL1表達水平。
　　研究結(jié)果：
　　(1)通過UBM觀察和測量主動脈弓處血管內(nèi)外徑比值(ID/OD)，LEE組中劑量

10、水平（0.1g/kg）和高劑量水平(0.5g/kg)、淫羊藿苷組低劑量水平(30mg/kg）和高劑量水平(60mg/kg)的ID/OD值與對照組相比明顯較大。LEE高劑量水平(0.5g/kg)、淫羊藿苷高劑量水平(60mg/kg)和辛伐他汀組(10mg/kg)的ID/OD值之間沒有明顯的統(tǒng)計學差異。表明LEE及淫羊藿苷可以有效抑制AS的進展，并且在高劑量水平時，其效果與辛伐他汀效果相當。
　　(2)通過油紅O染色和計算斑塊面積占主

11、動脈橫截面積的比例，LEE組高劑量水平(0.5g/kg)、淫羊藿苷組低劑量水平（30mg/kg）和高劑量水平(60mg/kg)斑塊面積占主動脈橫截面積與對照組相比明顯較小。LEE高劑量水平(0.5g/kg)和淫羊藿苷低劑量水平(30mg/kg)之間沒有明顯的統(tǒng)計學差異。淫羊藿苷高劑量水平(60mg/kg)和辛伐他汀組(10mg/kg)之間沒有明顯的統(tǒng)計學差異。表明LEE及淫羊藿苷可以有效抑制AS的進展，且淫羊藿苷在高劑量水平時，其效果與

12、辛伐他汀效果相當。
　　(3)通過MOMA-2染色評價單核巨噬細胞浸潤，LEE組中劑量水平（0.1g/kg）和高劑量水平(0.5g/kg)、淫羊藿苷高劑量水平（60mg/kg）的MOMA-2染色與對照組相比明顯較低。表明LEE及淫羊藿苷可以有效抑制AS中的單核巨噬細胞浸潤情況。
　　(4)ELISA法檢測ApoE-/-小鼠血清中的VCAM-1，ICAM-1，CX3CR1和CX3CL1的水平，LEE中劑量水平(0.1g/kg)

13、和高劑量水平(0.5g/kg)可以明顯降低小鼠血清中VCAM-1和ICAM-1的水平，而對CX3CR1和CX3CL1無明顯影響。淫羊藿苷高劑量水平(60mg/kg)可以明顯降低小鼠血清中CX3CR1和CX3CL1的水平，而對VCAM-1和ICAM-1無明顯影響。
　　(5)使用TNF-α刺激內(nèi)皮細胞建立內(nèi)皮細胞功能紊亂模型，以eNOS轉(zhuǎn)錄情況為指標，PCR檢測不同TNF-α濃度誘導下eNOS的轉(zhuǎn)錄水平，篩選了TNF-α的誘導濃度為

14、10ng/ml，而LEE的處理劑量為200μg/ml。
　　(6)粘附實驗中與對照組相比，TNF-α可以明顯增加THP-1向內(nèi)皮細胞的粘附，而LEE可以降低粘附率，抑制THP-1向內(nèi)皮細胞的粘附。
　　(7)Transwell實驗中與對照組相比，TNF-α可以明顯引起THP-1向內(nèi)皮細胞的遷移，而LEE可以抑制THP-1向內(nèi)皮細胞的遷移。
　　(8)使用western blot方法，檢測內(nèi)皮細胞所表達的與粘附和遷移相關(guān)

15、的粘附分子ICAM-1和趨化因子MCP-1。實驗結(jié)果表明，TNF-α可以顯著誘導內(nèi)皮細胞表達ICAM-1和MCP-1，而LEE可以降低ICAM-1和MCP-1的表達。
　　(9)使用熒光染色及Western blot檢測NF-κB激活和p65亞基的核轉(zhuǎn)移，實驗結(jié)果顯示TNF-α可以強烈誘導p65向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，而在給予LEE處理之后再使用TNF-α誘導的LEE組，p65向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移的情況受到了顯著的抑制。這表明LEE能夠抑制NF-κ

16、B的激活。
　　(1)LEE及淫羊藿苷可以明顯抑制AS的進展;
　　(2)LEE及淫羊藿苷可以明顯抑制AS斑塊中單核巨噬細胞浸潤情況;
　　(3)LEE和淫羊藿苷可以影響小鼠血清中粘附分子和趨化因子的水平
　　(4)LEE可以抑制TNF-α誘導的內(nèi)皮細胞功能紊亂
　　(5)LEE可以抑制TNF-α誘導的內(nèi)皮細胞中的NFκB的激活和p65亞基的核轉(zhuǎn)移;
　　(6)LEE可以抑制MAPK信號通路中ERK、

17、JNK的磷酸化。
　　(7)淫羊藿苷可以降低ApoE敲除小鼠主動脈壁中CX3CR1和CX3CL1的水平;
　　(8)淫羊藿苷可以降低LPS誘導的巨噬細胞中CX3CR1的表達水平;
　　(9)淫羊藿苷可以抑制巨噬細胞在CX3CL1誘導下的遷移。
　　LEE通過抑制內(nèi)皮細胞中MAPK信號通路中ERK、JNK的磷酸化而阻斷NFκB的激活，使相應(yīng)的粘附分子(ICAM-1)和趨化因子(MCP-1)表達減少，而減少了單核細胞