利用BAC克隆構(gòu)建PRV UL21缺失株及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)，又叫做奧葉茲基氏病病毒(Aujeszky'sdisease virus)、豬皰疹病毒Ⅰ型（Suid herpesvirus1），屬于皰疹病毒科的α皰疹病毒亞科，是世界上廣泛存在的一種病原物。偽狂犬病毒的天然宿主分布廣泛，它能夠感染除高等靈長(zhǎng)類以外的大多數(shù)哺乳動(dòng)物，最主要的天然宿主是豬。偽狂犬病毒能引起母豬的呼吸道炎癥、流產(chǎn)、死胎，以及仔豬的死亡，在我國(guó)每年都能造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失

2、。偽狂犬病毒基因組長(zhǎng)約為150Kb，其中包括長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)、短獨(dú)特區(qū)、內(nèi)部重復(fù)序列和末端重復(fù)序列。偽狂犬病毒基因組能夠編碼70種蛋白質(zhì)，分為結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白兩種。pUL21位于偽狂犬病毒的內(nèi)層被膜，在皰疹病毒科中諸多病毒都存在且序列保守，應(yīng)該是維持其毒力的重要基因。UL21基因被認(rèn)為參與了病毒粒子的包裝過(guò)程，其缺失株在復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)大量的未加工的基因組串聯(lián)體，而且不含基因組的衣殼比例也大大增加。目前有研究表明，修復(fù)UL21突變的PRV B

3、artha株在神經(jīng)細(xì)胞中的逆向軸突感染的速度增加，表明pUL21可能與病毒運(yùn)輸有關(guān)。
　　細(xì)菌人工染色體(bacteria artificial chromosome，BAC)是基于天然存在于大腸桿菌中的質(zhì)粒F因子設(shè)計(jì)的一種能夠容納大片段DNA插入序列的一種載體。BAC一經(jīng)問(wèn)世，便被廣泛用于構(gòu)建真核生物基因組文庫(kù)。BAC文庫(kù)有穩(wěn)定性強(qiáng)、插入片段長(zhǎng)、復(fù)制快、突變?nèi)菀椎膬?yōu)點(diǎn)。BAC用于克隆皰疹病毒基因組始于1997年，其首次應(yīng)用于小鼠

4、巨細(xì)胞病毒[1]，自此皰疹病毒的研究翻開(kāi)了新的篇章。由于通過(guò)BAC能夠在大腸桿菌中利用原核重組系統(tǒng)對(duì)病毒基因組進(jìn)行突變，省去了構(gòu)建重組毒時(shí)復(fù)雜繁瑣的過(guò)程，也節(jié)省了大量的時(shí)間，一時(shí)間該技術(shù)紛紛被用于各種皰疹病毒的基因編輯。
　　本研究出于研究UL21缺失對(duì)PRV增殖影響和新建立的BAC平臺(tái)構(gòu)建突變株效率的目的，構(gòu)建了UL21缺失株rPRV-△UL21及其回復(fù)突變株rPRV-△UL21R，并通過(guò)空斑大小比較實(shí)驗(yàn)研究其生物學(xué)特性。在構(gòu)建

5、rPRV-△UL21時(shí)先將擴(kuò)增的Kan表達(dá)盒電轉(zhuǎn)化含有pPRV Ea的GS1783，完成第一次Red重組;再分別誘導(dǎo)I-SceⅠ和Red操縱子表達(dá)，完成第二次重組。從兩次重組的PCR驗(yàn)證來(lái)看，重組效率不是很穩(wěn)定，但每一輪都能挑到陽(yáng)性克隆，而且并沒(méi)有受到質(zhì)粒殘留的影響。該結(jié)果說(shuō)明BAC基因編輯平臺(tái)穩(wěn)定可靠，能夠短時(shí)間內(nèi)構(gòu)建重組病毒，為病毒基因功能研究節(jié)省大量的時(shí)間精力。最后western blot驗(yàn)證結(jié)果表明，rPRV-△UL21完全不表

6、達(dá)UL21蛋白，說(shuō)明PRV的UL21缺失株的構(gòu)建非常成功。
　　隨后進(jìn)行的空斑大小比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rPRV-△UL21感染MDBK細(xì)胞上所產(chǎn)生的空斑大小明顯小于PRV Ea株，但是減小的幅度并不大。這說(shuō)明UL21的確影響PRV病毒在培養(yǎng)細(xì)胞上的增殖，但是其功能并不是復(fù)制必需的。
　　為了確保UL21基因的突變沒(méi)有影響與其重疊的lncRNA CTO-L的表達(dá)，本研究中采用了real time PCR來(lái)檢測(cè)感染病毒后12h的P