大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)的突變型佐劑活性及其作用機制研究.pdf

1、大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基（LTB）是一種很好的粘膜免疫佐劑，已有研究發(fā)現(xiàn)，LTB可以與細胞表面神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1）結(jié)合[1]，進而發(fā)揮佐劑效應(yīng)，除此之外，其他相關(guān)信號通路作用機制仍未有明確的報道，一直是推動進一步研究的瓶頸，因此，到目前為止粘膜免疫佐劑仍未被應(yīng)運到臨床中。本研究在野生型LTB的基礎(chǔ)上設(shè)計了4種T細胞和B細胞表位突變型，研究比較找出具有佐劑活性的突變型，進而為LTB詳細作用機制的進一步研究提供依據(jù)。
　　目的:

2、r>　　野生型LTB及其突變型的佐劑活性比較研究，初步評價LTB突變對其粘膜免疫佐劑活性的影響，找出佐劑增效相對較強的突變型，分析野生型LTB及其突變型的作用機制。
　　方法：
　　本研究利用高保真DNA聚合酶通過PCR的方法對LTB進行定位突變，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET32a-LTB26、pET32a-LTB34、pET32a-LTB57和pET32a-LTB85，通過菌液PCR檢測、質(zhì)粒酶切檢測以及測序驗證，鑒定突變型的正確

3、性，確定突變型蛋白表達的最適條件，誘導(dǎo)表達蛋白，通過SDS-PAGE檢測野生型LTB及4種突變型蛋白大小，采用His標簽純化蛋白，TGE透析復(fù)性，PEG8000對蛋白進行濃縮，得到高純度的LTB、LTB26、LTB34、LTB57和LTB85蛋白，去除蛋白內(nèi)毒素，分別聯(lián)合VP8免疫Balb/c雌性小鼠（免疫期間小鼠生命體征正常），收集小鼠的血清和肺洗液，采用間接ELISA法檢測血清和肺洗液中的 IgG和 sIgA水平。以Anti-NLR

4、P3、Anti-AKT1、Anti-MAP2K3和Anti-MAP2K4為一抗，通過免疫組化法檢測免疫小鼠鼻粘膜組織和脾臟組織中NLRP3、AKT1、MAP2K3和MAP2K4受體的表達量。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建pET32a-LTB26、pET32a-LTB34、pET32a-LTB57和pET32a-LTB85突變型重組質(zhì)粒。
　　2.在E.coli BL21（DE3）中表達了帶His標簽的LTB26、LTB

5、34、LTB57和 LTB85融合蛋白。ELISA實驗結(jié)果證明突變型 LTB26和LTB34聯(lián)合VP8免疫小鼠的血清和肺洗液中的特異性IgG和sIgA抗體水平明顯高于LTB聯(lián)合VP8組，初步篩選出了兩種佐劑活性進一步提高的突變型LTB26和LTB34。
　　3.免疫組化結(jié)果顯示：NLRP3在鼻粘膜 LTB+VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐劑組中的表達量均低于VP8對照組，相似地，NLRP3在脾臟組織LTB+VP8和

6、LTB26+VP8佐劑組中的表達也表現(xiàn)出了類似的趨勢；AKT1在鼻粘膜LTB26+VP8佐劑組中表達高于VP8對照組，其余各組均低于VP8組，而AKT1在脾臟組織LTB+VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐劑組中的表達均明顯高于VP8組（P＜0.05）；MAP2K3在鼻粘膜LTB+VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐劑組中的表達均低于VP8組和LTB57+VP8組（無統(tǒng)計學(xué)差異），而MAP2K3在脾臟組織LTB+

7、VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐劑組中的表達量均高于VP8和 LTB57+VP8對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；MAP2K4在鼻粘膜LTB+VP8和LTB26+VP8組的表達均稍高于VP8組，而MAP2K4在脾臟組織LTB+VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐劑組中的均明顯高于VP8組和LTB57+VP8組。
　　結(jié)論：
　　1.成功表達了帶His標簽的LTB26、LTB34、LTB57

8、和LTB85融合蛋白；
　　2.篩選出了佐劑活性進一步增強的突變型 LTB26和LTB34；
　　3.初步推測NLRP3與LTB及LTB26的佐劑增效機制無關(guān)；AKT1可能與LTB26突變型的佐劑增效機制呈正相關(guān)；MAP2K4與LTB和LTB26佐劑活性呈正相關(guān)性；MAP2K3在脾臟組織中與LTB及其突變體的佐劑活性呈負相關(guān)性，而在粘膜組織中與LTB及其突變體的佐劑活性呈正相關(guān)性，這種在不同免疫組織中的異質(zhì)性以及不同突變體在