多糖的分離純化及單糖組成分析研究.pdf

1、我國有豐富的中草藥資源和微生物資源,以它們?yōu)檠芯坎牧?提取、分離純化活性多糖,繼而研究其理化性質(zhì)及單糖組成,一方面為進(jìn)一步研究多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)、構(gòu)效關(guān)系及結(jié)構(gòu)對(duì)于其生物活性的影響提供良好的基礎(chǔ),另一方面也可以推動(dòng)糖化學(xué)的發(fā)展。
　　本文建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(HPLC-ELSD)法測定糖含量的方法，并應(yīng)用于天麻、南瓜、大蒜中果糖、葡萄糖及蔗糖含量的測定；從中藥甘草中分離得到甘草多糖(GP),并用HPLC-ELSD法測定了

2、其單糖組成;采用優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件從中藥大黃中提取了大黃多糖(RP),用氣相色譜(GC)測定了其單糖組成;利用深層發(fā)酵提取純化得到了白靈菇菌絲體多糖(PNMP)和白靈菇胞外多糖(PNEP),對(duì)這幾種多糖的理化性質(zhì)進(jìn)行了研究,利用GC測定了其單糖組成。
　　1. HPLC-ELSD法測定天麻、南瓜、大蒜中果糖、葡萄糖及蔗糖含量
　　建立了HPLC-ELSD法測定天麻、南瓜、大蒜中果糖、葡萄糖及蔗糖含量的方法。樣品經(jīng)熱水提取后,采用

3、Kromasil NH2(250 mm×4.6 mm,5μm)柱分離,以乙腈-水(80:20, V/V)為流動(dòng)相,使用ELSD檢測。結(jié)果表明該方法操作簡便、快速、準(zhǔn)確,用于實(shí)際樣品的測定結(jié)果令人滿意。
　　2.甘草多糖的分離純化及單糖組成分析
　　從中藥甘草中提取、分離純化出一種 GP。首先在單因素分析(提取溫度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù))的基礎(chǔ)上進(jìn)行L9(34)正交分析,優(yōu)化提取條件,正交實(shí)驗(yàn)表明,GP提取的優(yōu)化條件為:

4、溫度為90℃,提取時(shí)間為4 h,液固比為40:1,提取次數(shù)為3次。其次,在多糖的分離純化中,探討了Sevag法、凍融法和三氯乙酸法對(duì)GP粗提物進(jìn)行除蛋白處理的效果,結(jié)果表明,綜合考慮蛋白去除率、多糖損失率等因素,Sevag法優(yōu)于凍融法和三氯乙酸法,是適用于GP脫除蛋白的有效方法。將GP依次通過Sevag法除蛋白,H2O2脫色后上Toyopearl HW-55F凝膠柱純化得到一單組分,Toyopearl HW-50F凝膠柱鑒定其純度。最后

5、,通過紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)等儀器分析其性質(zhì),并由HPLC-ELSD法測定了GP的單糖組成,得出GP是一種葡聚糖,這與IR分析結(jié)果相吻合。
　　3.大黃多糖的分離純化及單糖組成分析
　　建立了一種提取、分離純化RP的方法。首先優(yōu)化了提取條件,正交實(shí)驗(yàn)表明, RP提取的優(yōu)化條件為:溫度為90℃,液固比為40:1,提取時(shí)間為4 h,提取次數(shù)為2次。其次,將粗多糖依次通過脫蛋白、除色素后上Toyopearl HW-55

6、F凝膠柱純化得到一單組分,Toyopearl HW-50F凝膠柱鑒定其純度。最后,通過UV、IR等儀器及化學(xué)方法分析其理化性質(zhì),用GC測定其單糖組成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,RP中含有糖醛酸,不含蛋白和核酸;IR圖譜分析顯示其具有多糖的特征吸收峰,以β-型糖苷鍵連接為主;GC分析其單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖,物質(zhì)的量之比為:23.56:157.12:17.85:1.00:67.54:58.35。
　　4.白靈菇

7、深層發(fā)酵多糖的分離純化及單糖組成分析
　　對(duì)白靈菇菌絲體和發(fā)酵液中的多糖進(jìn)行了初步的分離純化及單糖組成分析。經(jīng)深層發(fā)酵培養(yǎng)獲得白靈菇菌絲體和發(fā)酵液,并從中提取得到PNMP和PNEP;樣品經(jīng)脫蛋白、除色素后上Toyopearl HW-55F凝膠柱,PNMP分離得到兩個(gè)單一組分PNMPⅠ、PNMPⅡ,經(jīng) Toyopearl HW-50F凝膠層析柱鑒定其組分均相對(duì)單一,PNEP經(jīng)Toyopearl HW-55F凝膠柱純化得到一單組分,T

8、oyopearl HW-50F凝膠柱鑒定其純度。最后,通過UV、IR等儀器及化學(xué)方法分析了其理化性質(zhì),GC測定其單糖組成。實(shí)驗(yàn)證明,PNMPⅠ、PNEP中有糖醛酸的存在,PNMPⅡ?yàn)楹刑侨┧岬牡鞍锥嗵?經(jīng)IR圖譜分析,三者均有多糖的特征吸收峰,除此之外,PNMPⅠ中含有а-D-吡喃葡萄糖,PNMPⅡ中含有D-吡喃葡萄糖,PNEP中含有β-D-吡喃葡萄糖,且三者都具有吡喃環(huán)碳骨架等復(fù)雜的結(jié)構(gòu);GC測得PNMPⅠ、PNMPⅡ和PNEP均是