LGMD分子缺陷分析及基因治療的前期實驗研究.pdf

1、肢帶型肌營養(yǎng)不良是一組累及肩胛、骨盆帶和四肢近端肌肉的遺傳性疾病，根據遺傳模式，可將肢帶型肌營養(yǎng)不良分成常染色體顯性遺傳和隱性遺傳二類共15種類型，這些不同類型的肢帶型肌營養(yǎng)不良雖然在遺傳學上具高度異質性，但臨床表有十分類似之處，給臨床診斷帶來較大困難。 在本研究的第一部分，我們對臨床懷疑為隱性遺傳肢帶型肌營養(yǎng)不良一家系進行分析，以明確肌病類型并尋找其致病基因的分子缺陷。連鎖分析時我們用與8種隱性遺傳性肌營養(yǎng)不良基因連鎖的微衛(wèi)星

2、標記進行分析；檢測致病基因缺陷時共用與5種肌營養(yǎng)不良相關的單克隆抗體作多重免疫印跡分析檢測相應致病基因的編碼產物；最后通過RT-PCR擴增患者及家屬致病基因的編碼序列并測序確定基因突變。家系連鎖分析顯示在DYSF附近的D2S337位點的Lod score值為1.85，提示致病基因與D2S337連鎖，而這一標記位于DYSF基因附近；免疫印跡分析提示先證者DYSF基因的編碼產物dysferlin缺陷；測序證明患者DYSF基因的cDNA第64

3、29位發(fā)生純合性delG突變，這一突變使得dysferlin的合成提前終止。DYSF基因突變可導致LGMD2B或Miyoshil肌病，依據臨床資料和研究結果，這一家系中的患者被診斷為Miyoshi肌病,該家系為國內首次報道Miyoshi肌病家系，這一突變?yōu)閲H首次報道。 在研究另一臨床懷疑為肢帶型肌營養(yǎng)不良散發(fā)病例時，我們用RT-PCR擴增和測序技術分析calpain3基因的編碼序列和5’端序列是否存在突變。測序結果顯示患者C

4、APN3基因cDNA第706位發(fā)生雜合性G/A突變，基因的調控區(qū)序列未見突變。同時我們發(fā)現人類CAPN3基因在肌肉和外周血存在不同剪切方式，人外周血整個第15號外顯子被剪切掉，而肌肉組織則保留了第15號外顯子。 目前對肌營養(yǎng)不良這類遺傳性疾病尚無有效治療手段，目前處于研究中的肌母細胞移植時細胞排斥反應過強；肌源性干細胞治療因干細胞數量太少而難以應用： 而基因治療則仍有應用前景。從技術本身來看，阻斷被治療者體內一個基因的表

5、達也許比修復一個缺陷基因更容易。 Myostatin為TGF-β超家族中新發(fā)現的一員，又稱為轉化生長因子-8，是MSTN基因編碼的產物，它也是目前已發(fā)現的唯一一個肌肉生長的負調節(jié)因子。有研究顯示MSTN基因被敲除的小鼠的肌纖維數目明顯增加，肌肉重量比相應的野生型小鼠重2～3倍。 在本研究的第二部分我們用較為理想的阻斷基因表達的siRNA技術阻斷MSTN基因的表達，期望通過抑制肌肉生長的負調節(jié)因子而使患者的肌肉萎縮與壞死的

6、癥狀得到改善，為此我們構建了三個siRNA表達載體，并將它們轉染到肌母細胞中，通過實時熒光定量逆轉錄PCR、Western blot和細胞免疫化學等技術鑒定siRNA沉默肌母細胞MSTN基因的效率。實時熒光定量PCR顯示我們所構建的三個siRNA表達載體的干擾率分別為43.6％、47.7％和81.6％，它們的干擾效果也被Western blot所證實。我們選擇干擾率最高的siRNA表達載體轉染的肌母細胞進一步培養(yǎng)，觀察MSTN基因被干擾

7、后肌母細胞的增殖和分化能力。計數結果顯示在相同培養(yǎng)條件下，與對照細胞相比，轉染siRNA表達載體的肌母細胞數目明顯增加，細胞肌酸激酶活力也明顯升高。形態(tài)學觀察顯示轉染siRNA表達載體的肌母細胞在含2％胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天細胞仍未能分化形成肌管，而作為對照的未轉染細胞在7天內已開始分化形成肌管。細胞超微結構觀察顯示轉染siRNA表達載體的肌母細胞表面出現大量微絨毛，而對照的未轉染細胞僅出現少量微絨毛。因此肌母細胞的MS